Distinctive Roles of PHAP Proteins and Prothymosin-α

Regulatory Pathway

Jiang, X. et al. SCIENCE, 299, 223-226. (2003)

Apoptosis是一細胞計劃性的死亡，在動物體內，用以維持體內環境平衡及發展的機制。Apoptosis與許多疾病相關，包括：當細胞計劃性死亡不正常的被抑制，會造成腫瘤的新生及自體免疫的疾病。然而，過度的細胞死亡，會產生神經退化性的疾病。因此，美國國家衛生組織The National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS)在2001年向外甄求，希望以high throughput drug screening (HTS) 的理念，來設計實驗，企圖尋找與Apoptosis相關的藥物，並且探討疾病的機制。由於傳統新藥研發平均需要十四年之久，作者在這篇文章當中，則利用了HTS的理念，篩選化合物資料庫中的化學成份，利用許多體外的實驗，試著尋找新藥的來源。所以，設計了藉由刺激caspase-3的活化的實驗，來尋找與Apoptosis相關的藥物，總共篩選了184,000種化合物，發現了28種有反應。之後測其EC₅₀^，s值，發現6種化合物有效，其中以α- (trichloromethyl) - 4 – pyridineethanol （PETCM）是最有反應的化合物。接著作者以PETCM處理細胞，發現隨著時間點及劑量的增加，都能有效的增加caspase-3的活性。另外，作者結合了Biochemical fractionation approach，利用Fast performance liquid chromatography (FPLC) 的系統，來純化相關的蛋白質，以進一步探討藥物的作用機制。結果發現PETCM會促使apoptosome的形成。為了瞭解藥物的作用機制，作者更進一步以陰離子交換層析法，萃取不同反應物，並加入PETCM及dATP處理細胞，發現了活化caspase-3除了cytochrome c，Apaf-1，caspase-9還需要PHAPI的參與。接著，也意外的發現了Prothymosin-a ( ProT-a ) 會抑制caspase-3的活性，但這樣的抑制效果會被PETCM所拮抗。作者為了確認此二分子與apoptosome的相關性，發現ProT-a會藉由阻斷apoptosome的形成，而抑制caspase-3的活性；而PHAPI則是不會影響apoptosome的形成，但會增加caspase-9的活化。最後，作者進行細胞內實驗，設計ProT-a siRNA處理細胞，再外加PETCM的實驗，再次的確認PETCM此化合物的作用。

所以本篇文章，其實驗結果發現PETCM會藉由拮抗ProT-a的抑制效果，進而使細胞走向計劃性死亡。另外，也發現了ProT-a和PHAPI在細胞計劃性死亡的過程中，扮演調節者之角色。

這篇文章其重要性在於其以HTS的理念，設計了一套可大量且快速篩選藥物的方法。利用生化萃取的策略，發現在apoptosis的訊息傳導路徑當中，ProT-a會抑制apoptsome的形成，進而抑制apoptosis的進行；PHAP會促進caspase-9的活化，進而促進apoptosis的進行。此外，PETCM會藉由拮抗ProT-a的抑制效果，進而促使細胞apoptosis的發生。