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報告日期： 2003年4月9日    講評老師： 黃 朝 慶  醫師

  微免所 碩士班 一年級   許  聿  翹

Activated protein C blocks p53-mediated apoptosis in ischemic human brain endothelium and is neuroprotective

Cheng, T. et al. Nat. Med. 9, 338-342

1.     Introduction：

Ø       Stroke（中風）是指當通往腦部的血流受到阻斷，而無法供給腦部氧氣造成身體機能受損的一種疾病。中風的類型有很多種，其中最重要的兩種分別是Ischemic stroke（阻塞性或缺氧性中風）和hemorrhagic stroke（出血性中風或腦溢血）

Ø       Protein C是一種proenzyme，經由一個vitamin K-dependent pathway在肝臟合成，並在血液裡循環。當血液中的thrombin和thrombomodulin 結合之後，Protein C會被活化成activated protein C (APC)

Ø       APC是一種serine protease可以經由高特異性的proteolysis切割凝血因子，達到其抗凝血機制。APC在許多animal models中被證實具有減少中風和敗血症器官衰竭的現象。目前被用來當做治療嚴重敗血症的臨床藥物。

2.     Hypothesis：

在本篇paper之中，作者參考Riewald等人在2002年Science所發表的一篇文章，指出在內皮細胞中Activated protein C (APC) 利用endothelial cell PC receptor (EPCR) 當作一個coreceptor 來切割protease activated receptor 1 (PAR1) ，藉由這個receptor cascade 來達到保護細胞對抗敗血症的機制。

於是作者假設，中風所造成的缺氧情況會引發p53相關的apoptosis，而藉由APC與內皮細胞上面的EPCR結合，透過PAR1的參與，傳遞訊息達到抑制p53的表現，進而減少apoptosis的情況。

3.  Results：

作者以先前的假設進行in vitro和 in vivo的實驗：

B.       In vitro experiments：

Ø       以Brain endothelial cell (BECs) 作為hypoxia model（0₂<2%），證明在缺氧情況下，會進行apoptosis，釋出Lactate dehydrogenase。而APC 具有一個dose-dependent的細胞保護作用，可以減少缺氧對BECs 造成的傷害。

Ø       利用TUNEL stain證明APC 缺氧的BECs中具有一個dose-dependent anti-apoptotic effect且半有效濃度（EC₅₀）為15 nM。

Ø       證明APC 本身有直接的細胞保護作用並且其active-site的serine是保護作用所必須的。

Ø       證明在腦部內皮細胞中因為缺氧所造成的傷害牽涉了pro-apoptotic transcription factor p53 以及pro-apoptotic Bax/Bcl-2 比值的上升。

Ø       缺氧情況開始的三十分鐘內，引發快速的transient increase in p53 mRNA transcripts且此現象可以明顯的被APC所抑制。APC並可以normalize Bax/Bcl-2 的比值。

Ø       藉由測定IAP-1、Bcl-2 homolog A1及endothelial nitric oxide synthase (eNOS)在缺氧情況下加入APC與否的表現，因為沒有差異可以排除這些因子造成細胞保護現象的可能性。

C.   In vivo experiments：

Ø       作者使用一種手術模擬中風情況，稱做大白鼠中大腦動脈阻塞Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO)。也就是在白鼠的頸動脈伸入一條導管阻塞白鼠右側腦部的MCA血流，使對側肢體產生病變。

Ø       進行MCAO之後十分鐘給予APC(0.2 mg/kg) 治療，發現APC具有減少腦部阻塞量及水腫量的功能。

作者利用低劑量 (0.04 mg/kg) 與高劑量 high-dose (0.2 mg/kg)的APC治療，發現在白鼠的motor neurological score與brain injury上都有dose-dependent的保護作用，但是在Post-ischemic CBF(cerebral blood flow) 、Fibrin deposition與CD11b+ leukocytes 的數量上，低劑量的APC給予並不具有保護效果，因此作者認為，再高劑量時也許保護功能有包含anti-apoptosis、anti-coagulant、anti-inflammatory的機制，但是在低劑量可以看出來這種保護機制是來自於anti-apoptosis，且非anti-coagulant和anti-inflammatory的secondary mechanism。

4.  Possible application：

Tissue plasminogen activator (tPA)是目前唯一經由美國FDA核准臨床治療中風的藥物，但是tPA對腦部細胞具有直接的毒性，且必須在中風的三小時之內使用才有效。作者認為經由實驗證實APC對腦部的缺氧性傷害具有保護作用，也許將來可以應用在缺氧性中風的臨床治療，對腦細胞也不具有毒性，目前這項藥物以再進行臨床實驗。

5.  References：

1.    Shibata, M. et al. (2001) Anti-inflammatory, anti-thrombotic, and neuroprotective effects of activated protein C in a murine model of focal ischemic stroke. Circulation 103, 1799-1805.

2.    Riewald, M. et al. (2002) Activation of endothelial cell protease activated receptor 1 by the protein C pathway. Science 296, 1880-1882

3.    Folsom, A. R. et al. (1999)Prospective study of markers of homeostatic functions with risk of ischemic stroke. Circulation 100, 736-742

4.    Joyce, D. E. et al. (2001)Gene expression profile of antithrombotic protein C defines new mechanisms modulating inflammation and apoptosis. J. Biol. Chem. 276, 11199-11203