mRNA instability in the nucleus due to a novel open reading frame element is a major determinant of the narrow tissue specificity of folate receptor alpha                                       陳天文

這是一遍出自於MCB2003年的paper，題目主要的意思是在說，作者發現表現floate receptor alpha 在特定組織上的調控，主要是由floate receptor alpha的mRNA在nucleus中的不穩定所造成的，而調控的方法是一個全新的發現: 一段open reading frame element所導致的。

    Folate receptor type α (FR-α) 在當成tumor marker和tumor target治療上是大有可為的。在這裡，作者研究了FR-α在tumor specificity和過度表現上的運作機製。利用幾個代表性的細胞株: FR-α (+)有HeLa和JAR，FR-α (-)有MG63、Cakil和HT3，在它們endogenous FR-α gene的transcription rate和它們的FR-α promoter activity是一樣相對弱的，但是在FR-α (+)細胞內，它們的total RNA和在nucleus的RNA則是豐富的。利用Rous sarcoma virus (RSV) promoter-driven expression of the FR-α gene，不論在protein和mRNA levels上，FR-α (+)都要比FR-α (-)來得高到7-30倍，而且証明了和intron sequences是不相關的(splicing)。透過使用chimeric FR-α/FR-β cDNAs來表現FR-α，發現在FR-α opening reading frame的一段60-bp sequence會影響FR-α的表現。將這一段sequence element放置在RSV promoter-luciferase的5’UTR區域，發現利用FR-α(-)來表現的細胞和FR-α(+)來比較，減少reporter expression約有7-20倍。使用FR-α element來取代在FR-β上，發現在MG63的細胞核內transcript rate減少了，但在HeLa的細胞核和MG63跟HeLa的細胞質上則沒有此一現象看到。這樣的結果顯示一個全新的sequence element機製會導致在細胞核內有不同的transcription degradation來達到對特定基因的narrow tissue specificity，特別是在這些基因表現是比較弱的和沒有選擇性的細胞上。最後，在整個cell cycle上的FR-α mRNA表現是穩定的，而且只有綬慢的protein turnover，因此，猜想FR-α receptor是高度穩定的，但是能被細胞核內的mRNA instability所決定。

l          The model cell lines are not significantly different in FR-α gene copy number, gross gene organization, and transcription rates

由實驗Southern blotting和restriction amp analysis來分析各個cell llines的genomics DNA，發現結果並沒有明顯的差異(data not show)，因此可排除FR-α的表現差異是來自於genomics DNA上的FR-α gene的copy number或是gross gene organization所造成。

而由nuclear run-on experiments發現在HeLa和JAR這二個細胞上有過度表現FR-α，但沒有在MG63，Cakil和HT3上有看到(圖一)。

l          P4 is the major but relatively weak promoter

由transient transfections with promoter-luciferase reporter constructs中發現，P4 promoter fragment (nt -271 to +33)相對於P1 promoter fragment (-3394 to -2468)的活性是多出25-80倍。而將P4 promoter給去除掉，則活性下降了90-100%。因此P4在所有的cell lines中是主要表現的promoter，利用5’RACE PCR也確定了由P4 promoter-drivern transctipt(results not shown)。再來比較由RSV promoter-luciferase construct和P4 promoter-luciferase的活性比較，發現只有2-8%(和RSV promoter-luciferase相比)。在各細胞表現endogenous FR-α上，各細胞的活性並沒有不同。

l          Differential FR-α expression reflects relative cytosolic and nuclear transcript levels

利用[3H] folic acid binding assay發現Cakil, MG63和HT3是沒有差異的，而HeLa和JAR也是一樣，在利用Northern blot看total mRNA量上也是一致的。利用real time RT-PCR則觀察到在細胞核內的pre-mRNA的表現，可以看到在MG63, Cakil和HT3表現量很少，只有在HeL

l          Differential FR-α expression occurs by a posttranscriptional mechanism and is independent of introns

利用P4 promoter 來transcription entire FR-α gene(包含introns)和利用RSV promoter driver FR-α cDNA來看二者是否有差異，由結果來看並沒有很大的差異，反而由RSV promoter driver FR-α 所表現protein較穩定，因此結果代表FR-α的調控是在posttranscription，但不是和hnRNA splicing有相關的。

l          Mapping of a regulatory element in FR-α by using chimeric FR-α/FR-β

為了去查清楚是什麼調控著FR-α的表現，作者construct了RSV promoter-FR-β cDNA到HeLa和MG63 cells中表現，發現在binding folic acid上沒有明顯差異。因此利用RSV promoter-FR-β cDNA來mapping FR-α發現了在FR-α ORF 一段60 bp的sequence(相對於P4 promoter +1位置在234到293)，在FR-α的tissue specificity上，扮演著重要角色，而其它FR- α位置則被排除。

l          The 60-bp FR-α element can transfer the tissue specificity of FR-α to luciferase

利用不同的60-bp sequence的FR-α和FR-β(相對位置一樣)分別constructs到RSV-Luc expression in various cell lines中，來偵測luciferase activity，發現只有在FR-α(-)中的FR-α element有明顯差異，証明只有FR-α element有調節的效果，而且只有對FR-α(-) cell lines有影響。

l          The 60-bp FR-α element causes differential mRNA stability in the nucleus but not in the cytosol

利用Tet-off expression plasmids來檢查FR-β和chimeric FR-β分別在nuclear mRNA的表現和在total mRAN的表現，發現只有在MG63 cell的FR-β chimeric的nuclear mRNA表現量隨著時間的不同有差異，其它無論在nuclear或total mRNA則無差異產生。而在HeLa cell中則觀察到chimeric FR-β mRNA甚至比FR-β mRAN來的穩定。

l          FR-α expression in the HeLa cells is constitutive, and the protein turnover is slow

為了更進一步了解FR-α在HeLa cell的過度表現，作者測量了在各cell cycle的FR-α的transcription和新合成的protein。由nuclear run-on experiments中發現，HeLa cell只有在S和G2/M期有明顯觀察到transcription rate的發生，而在測量新合成的folate receptor上，則是在整個cell cycle上都有觀察到，但把S期和G2和M期相比，則有高出2-3倍的合成速率，最後利用[35S]cysteine pulse-chase experiments則發現在HeLa cell上的folate receptor的half-life>24 h。因此，在HeLa cell上看到高表現的folate receptor主要是來自於protein的持績合成及高穩定的表現在membrane上。