Vibrio harveyi quorum sensing: a coincidence detector for two autoinducers controls gene expression 林貞杏

 

簡介:

細菌屬於原核生物，沒有像真核生物一樣具有真正的核，同時細菌也是單細胞生物，因此細菌不像多細胞生物具有細胞分化的現象，當細菌要維持其正常生長時，其生長所需的養分及能量必須在一個細胞內全部完成。而在近幾年的研究中發現，多細胞生物個體內的細胞具有彼此溝通的能力，而此溝通能力的存在，科學家認為可說明個體在適應不同環境時，可藉此能力來加以調控個體內基因的表現，以維持此個體的正常生長。如果在多細胞生物內已觀察到這種現象，那麼細菌呢？是否也和多細胞生物一樣具有彼此溝通的能力？

在70年代，Hastings and Nealson發現生長在海洋中的某弧菌，Vibrio fisheri,是一種會發光的細菌，且Vibrio fisheri發光的現象，只有在Vibrio fisheri群族密度高時才可觀察到，反之若將其菌濃度加以稀釋，則此發光現象就會消失。而此現象引起了許多科學家的興趣，究竟在Vibrio fisheri體內有什麼機制可使Vibrio fisheri發光？同時發光現象代表的意義又是什麼？

經過幾年的研究，科學家終於找出原來Vibrio fisheri會製造某一化學訊號分子，稱為autoinducer，而且Vibrio fisheri的細胞表面也具有此分子的受器，可接收此分子並進而調控細菌體內一些基因的表現。目前，科學家已描繪出一藍圖，當Vibrio fisheri在海洋內生活時，會製造autoinducer並進而排到體外，當Vibrio fisheri的族群愈來愈大時，環境內的autoinducers的濃度就愈來愈高，因此，Vibrio fisheri很容易就可利用受器和環境內的autoinducers結合，進入Vibrio fisheri和LuxR結合並進而啟動Vibrio fisheri體內的lux operon，此時Vibrio fisheri就開始發光！後來，科學家就把這種依據細菌族群大小的不同而使得基因表現有所改變的現象稱之為“quorum sensing”。

    

LuxR

autoinducers

+

luxR

G

E

B

luxI

C

D

A

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

隨後，科學家不止在Vibrio fisheri觀察到quorum sensing的情形，於另一生長於海洋的弧菌，Vibrio harveyi，也觀察到類似的情形，於是科學家在加以研究之後發現，Vibrio harveyi具有兩種autoinducers,分別是autoinducer 1及autoinducer 2.同時經由和不同種的細菌比較後，科學家發現autoinducer 1只存在於V. harveyi and V.parahaemolyticus，至於autoinducer 2則廣泛存在於不同種的細菌內（包含革蘭氏陽性菌及陰性菌）。因此目前被認為autoinducer 1在V. harveyi 體內主要是負責同種細菌內的溝通，至於autoinducer 2則是負責不同種細菌的溝通。而這樣的假設似乎也和V. harveyi生存的環境（海洋中遍布不同種的細菌）不謀而合。目前，科學家認為在V. harveyi體內其quorum sensing的調控路逕如下：

                                                                                                                                          

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

在low cell density時，LuxQ及LuxN（autoinducer的sensor）在未接收到autoinducer時，會行自磷酸化作用，並進而將LuxU及LuxO磷酸化，此時LuxO-P就成為repressor，並抑制LuxCDABE的基因表現，因此我們無法看到發光的現象。  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

當細菌生長的濃度超過某一程度，此時環境中autoinducer所累積的量也很多時，就能和LuxN及LuxP結合，此時兩個sensor就會行去磷酸化作用，同時也將LuxU及LuxO去磷酸化，當LuxO被去磷酸化後，就無法扮演repressor的角色，因此  

LuxCDABE就可被啟動，此時，我們就可看到會發光的細菌。

 

當科學家了解quorum sensing的機制後，另一個問題又跑出來了，既然細菌擁有一個這麼巧妙的系統來調控其基因表現，是否還有其他和發光不相關的基因也受此系統調控。於是針對這個問題又做了許多研究，後來，科學家果然在其他細菌，如大腸桿菌，金黃色葡萄球菌…等，發現這些細菌的毒力因子似乎也受到quorum sensing的調控 (Sperandio et al,. 1999; Kim et al,. 2000; Lyon. et al,. 2000) 。

 

目的:

因此在這篇研究當中，作者想去探討兩個問題：一、在V. harveyi中，除了LuxCDABE外，是否還有其他基因也受quorum sensing調控？二、釐清細菌與細菌溝通時，AI-1與AI-2的角色？

 

結果:

1、一開始，作者想找出可被AI-2調控的基因，因此利用Mini-MulacZ insertion mutagenesis的方式作用在作者原有的一菌株(AI-1+，AI-2-)上，收集大量的突變株，結果作者總共篩選到10 colonies是可被AI-2調控。其中KM87是可被AI-2活化，而其他九株則是受到AI-2的抑制。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                     

2、接著，作者將這十個colonies利用DNA定序的方式，找出受到AI-2調控的基因分別如下：

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3、找出十個受到AI-2調控的基因後，作者想進一步去了解經由AI-2去調控這十個基因的路徑是否和quorum sensing有關連。因此作者提出了兩個假設：1、此調控路徑和quorum sensing不相關，若是如此，則AI-1就無法去影響這些基因的表現。2、此調控路徑和 quorum sensing有相關，若是如此，則在突變株所觀察到的結果，則告訴我們：只有AI-1的存在並不足以使LuxO的作用完全被抑制住。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

為了想證實哪個假設才是正確的，作者將一在47位置的D變成E的luxO序列送進十個colonies內，由於此突變的luxO已變成一持續表現的抑制子，所以此luxO無法受到quorum sensing的調控。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

由結果中，我們可發現當送入一持續表現的luxO後，KM87及KM114都受到影響，因此作者認為經由AI-2來影響基因表現的路徑是透過quorum sensing來調控。

4、當確定此調控路徑是經由quorum sensing後，由於AI-1也屬於quorum sensing的一部分，因此作者想去了解這些會受到AI-2調控的基因是否也會受到AI-1的調控，因此作者製備了inframe deletion的luxLM (製造AI-1的基因) DNA片段，並送入這十個colonies進行同源性基因重組，

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

由結果中我們可知，確實AI-1及AI-2都會調控此十個基因。

 

5、最後，作者就想知道既然AI-1及AI-2都會調控此十個基因，那麼AI-1及AI-2的角色孰輕孰重？因此，作者就外加不同比例的AI-1及AI-2，或是添加不同比例的wild type supernatant去了解這十個基因被調控的情形是否有所改變？

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

由上述結果，我們可以知道:

1、在V.harveyi 內，針對可被quorum sensing所調控的基因而言，AI-1及AI-2都是非常重要的。

2、只要這兩種autoinducers 都存在，不管其比例為何，或是兩者的量都非常少還是可以有效地去調控基因。

 

結論：

經由上述的實驗結果，作者認為:

1、在V.harveyi內，quorum sensing此系統似乎為一“ coincidence detector”，可以分辨兩種autoinducers的存在與否，並將此訊號整合起來，使下游的基因可以受到調控。事實上，在許多生物個內，有許多系統就是以coincidence detector的方式存在，如視神經及聽神經的傳遞路徑 (Joris et al., 1998; Pena et al., 2001)。

2、在本次實驗中所找到的十個基因，其調控的方式乃是AI-1及AI-2共同配合而成。