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為了基礎研究及工業界大量表現蛋白質的需求，T7表現系統已廣泛的使用於大腸桿菌，並且也已在其他的生物系統建立。 由於每一種系統都有其限制性，例如: 對高溫之耐受性、分泌機制等， 因此發展一套可以耐高溫及分泌蛋白質之系統，便有其必要性。 基於枯草桿菌其生理及遺傳特性之瞭解，本研究擬嘗試用此菌建立一不需誘導子(inducer)就能夠表現蛋白質的T7表現系統。 枯草桿菌spoVA啟動子為spoVA operon的一部份，此啟動子的表現受到 G的控制，表現的時機為產孢作用啟使後約3 ~ 5小時，而T7 RNA polymerase (T7 RNAP) 的特性為轉錄作用的速度快以及辨別啟動子的專一性高。 利用T7 RNAP基因，與spoVA啟動子結合構築於枯草桿菌及大腸桿菌之穿梭質體pHP13，使得T7 RNAP受到spoVA啟動子的調控。 構築完成的質體，經過DNA定序法確認後，命名為pMW205。 質體pMW216含有鏈激之基因由T7啟動子所控制。 將質體pMW216 (Emr, 複製數量約100 copies/chromosome) 與pMW205 (Emr, Cmr) 一起轉型進入蛋白缺乏之枯草桿菌DB428，由於抗生素篩選的因素，發現pMW216不能穩定的與pMW205共同的存在於DB428菌株中。 於是利用pMW230 (Tetr, 複製數量約5 copies/chromosome) 為報導質體，結果並未能偵測到標的蛋白質的表現。 為提高報導質體的複製數量，利用載體pUB110與pMW209融合，構築報導質體pMW238 (Kanr, 複製數量約50 copies/chromosome)，發現不需pMW205的存在，就可利用西方墨漬法偵測到持續性標的蛋白質的微量表現，由此可知此報導質體並未受到spoVA誘發之T7 RNAP所調控，但似乎可利用載體本身之啟動子做微量的表現標的基因。 雖然目前無法利用spoVA誘發性T7表現系統以表現蛋白質，但利用載體pUB110之特性，可以微量的表現標的蛋白質。
產氣單胞菌為革蘭氏陰性桿菌，對於catalase及oxidase均呈陽性反應。 與創傷弧菌相似，產氣單胞菌為許多水生動物之致病菌，而人類許多的感染性疾病與此屬細菌亦有所關聯。 在體外的環境，對於cefotaxime單獨作用下，易選殖出抗藥性突變菌株的嚴重問題。 先前的研究發現，cefotaxime 及minocycline合併用藥，對於創傷弧菌，不論是體外或者是體內的環境下都具有協同抑菌的作用。 而且嗜水性產氣單胞菌臨床菌株，對於minocycline較其他tetracycline類藥物更具感受性。 因此，本實驗利用對cefotaxime具不同感受性但基因型相同之二株嗜水性產氣單胞菌臨床菌株，A136及A139為材料，研究cefotaxime及minocycline合併用藥，對嗜水性產氣單胞菌之影響。 A136, 為cefotaxime具感受性菌株在cefotaxime 6 g/ml (8倍最小抑制濃度)或minocycline 6 g/ml (2倍最小抑制濃度)的環境下，均於短時間內恢復正常生長並無抑制的現象。 但是在cefotaxime 3 g/ml (4倍最小抑制濃度)或minocycline 2 g/ml (2/3倍最小抑制濃度)的合併作用下，則至少有48小時的抑菌效果。 A139, 為cefotaxime的抗藥性菌株，其於cefotaxime 32 g/ml 及minocycline 4 g/ml (2倍最小抑制濃度)的作用下，亦產生相似於A136的抑菌效果。 這結果證實在體外的環境下，cefotaxime及minocycline合併用藥，對於嗜水性產氣單胞菌可產生協同性的抑菌作用。 此外，本論文亦對於產氣單胞菌臨床菌株，從事O:11血清型及基因分型的鑑定與分析。 分析O:11血清型產氣單胞菌臨床菌株與檢體來源的相關性時發現O:11血清型菌株與侵犯性感染無關。 另外，利用rRNA基因分型的方式，對75株產氣單胞菌臨床菌株，作進一步雜交分型，發現不論是A. hydrophila或是A. sobria其各型的分佈與先前的報告相似，但是A. caviae則有明顯的差異。
為了基礎研究及工業界大量表現蛋白質的需求，T7表現系統已廣泛的使用於大腸桿菌，並且也已在其他的生物系統建立。 由於每一種系統都有其限制性，例如: 對高溫之耐受性、分泌機制等， 因此發展一套可以耐高溫及分泌蛋白質之系統，便有其必要性。 基於枯草桿菌其生理及遺傳特性之瞭解，本研究擬嘗試用此菌建立一不需誘導子(inducer)就能夠表現蛋白質的T7表現系統。 枯草桿菌spoVA啟動子為spoVA operon的一部份，此啟動子的表現受到 G的控制，表現的時機為產孢作用啟使後約3 ~ 5小時，而T7 RNA polymerase (T7 RNAP) 的特性為轉錄作用的速度快以及辨別啟動子的專一性高。 利用T7 RNAP基因，與spoVA啟動子結合構築於枯草桿菌及大腸桿菌之穿梭質體pHP13，使得T7 RNAP受到spoVA啟動子的調控。 構築完成的質體，經過DNA定序法確認後，命名為pMW205。 質體pMW216含有鏈激之基因由T7啟動子所控制。 將質體pMW216 (Emr, 複製數量約100 copies/chromosome) 與pMW205 (Emr, Cmr) 一起轉型進入蛋白缺乏之枯草桿菌DB428，由於抗生素篩選的因素，發現pMW216不能穩定的與pMW205共同的存在於DB428菌株中。 於是利用pMW230 (Tetr, 複製數量約5 copies/chromosome) 為報導質體，結果並未能偵測到標的蛋白質的表現。 為提高報導質體的複製數量，利用載體pUB110與pMW209融合，構築報導質體pMW238 (Kanr, 複製數量約50 copies/chromosome)，發現不需pMW205的存在，就可利用西方墨漬法偵測到持續性標的蛋白質的微量表現，由此可知此報導質體並未受到spoVA誘發之T7 RNAP所調控，但似乎可利用載體本身之啟動子做微量的表現標的基因。 雖然目前無法利用spoVA誘發性T7表現系統以表現蛋白質，但利用載體pUB110之特性，可以微量的表現標的蛋白質。
產氣單胞菌為革蘭氏陰性桿菌，對於catalase及oxidase均呈陽性反應。 與創傷弧菌相似，產氣單胞菌為許多水生動物之致病菌，而人類許多的感染性疾病與此屬細菌亦有所關聯。 在體外的環境，對於cefotaxime單獨作用下，易選殖出抗藥性突變菌株的嚴重問題。 先前的研究發現，cefotaxime 及minocycline合併用藥，對於創傷弧菌，不論是體外或者是體內的環境下都具有協同抑菌的作用。 而且嗜水性產氣單胞菌臨床菌株，對於minocycline較其他tetracycline類藥物更具感受性。 因此，本實驗利用對cefotaxime具不同感受性但基因型相同之二株嗜水性產氣單胞菌臨床菌株，A136及A139為材料，研究cefotaxime及minocycline合併用藥，對嗜水性產氣單胞菌之影響。 A136, 為cefotaxime具感受性菌株在cefotaxime 6 g/ml (8倍最小抑制濃度)或minocycline 6 g/ml (2倍最小抑制濃度)的環境下，均於短時間內恢復正常生長並無抑制的現象。 但是在cefotaxime 3 g/ml (4倍最小抑制濃度)或minocycline 2 g/ml (2/3倍最小抑制濃度)的合併作用下，則至少有48小時的抑菌效果。 A139, 為cefotaxime的抗藥性菌株，其於cefotaxime 32 g/ml 及minocycline 4 g/ml (2倍最小抑制濃度)的作用下，亦產生相似於A136的抑菌效果。 這結果證實在體外的環境下，cefotaxime及minocycline合併用藥，對於嗜水性產氣單胞菌可產生協同性的抑菌作用。 此外，本論文亦對於產氣單胞菌臨床菌株，從事O:11血清型及基因分型的鑑定與分析。 分析O:11血清型產氣單胞菌臨床菌株與檢體來源的相關性時發現O:11血清型菌株與侵犯性感染無關。 另外，利用rRNA基因分型的方式，對75株產氣單胞菌臨床菌株，作進一步雜交分型，發現不論是A. hydrophila或是A. sobria其各型的分佈與先前的報告相似，但是A. caviae則有明顯的差異。
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For the demands of biological research and industrial purposes, the T7 expression system has been established in Escherichia coli, and other hosts. However, certain limitations of the systems do exist, such as the stability of microorganism at high temperature, and the mechanism of secretion, etc. Because the physiological and genetical characteristics of Bacillus subtilis are known, the aim of this project was trying to construct a spoVA inducible T7 expression system without an inducer in B. subtilis. In B. subtilis, spoVA promoter is controlled by the transcription factor-sigma G. It can express during 3-5 hours after the sporulation initiation. The characters of T7 RNAP are fast of transcription and specific recognition of it’s promoter. Plasmid pHP13, a shuttle vector of E. coli and B. subtilis, was used for the construction of T7 RNAP gene under spoVA promoter control. The construct was confirmed by restriction enzyme analysis and DNA sequencing and designated as pMW205. Plasmid pMW216 contains the truncated streptokinase gene under the T7 promoter control. Both plasmids pMW216 (Emr, copy no.~100 copies/chromosome) and pMW205 (Emr, Cmr) were transformed into DB428, a protease deficient strain. Because of the problem of antibiotic selection, plasmid pMW216 could not co-transform with plasmid pMW205 into strain DB428. In order to solve this problem, pMW230 (Tetr, copy no. ~5 copies/chromosome) was used to construct the expression vector. However, no target protein was detected by western blot analysis. Plasmids pUB110 and pMW209 (E. coli T7 reporter plasmid) were fused for increasing copy number of reporter plasmid and designated as pMW238 (Kanr, copy no.~50 copies/ chromosome),. The target protein could be constitutively expressed without the presence of the plasmid pMW205. These results indicate that reporter plasmid was not controlled by spoVA inducible T7RNAP. Although it could not express target protein by spoVA inducible T7 expression system, the plasmid pUB110, could express small amount of target protein directly.
Aeromonas species are gram-negative bacilli with positive catalase and oxidase reactions. The clinical spectrum is similar to Vibrio vulnificus. It not only causes diseases in aquatic animals, but also in humans. The resistance is easily selected, when cefotaxime (CTX) is treated in vitro. Because the regimen of CTX and minocycline (MIN) combination has been demonstrated to be synergistic against V. vulnificus in vitro and in a murine experiment. MIN is the most active of among three tetracycline analogues. Two clinical isolates of A. hydrophila, A136 and A139, were used to study antibiotics combination against A. hydrophila. Strain A136, cefotaxime-sensitive A. hydrophila, grew rapidly with 6 g/ml of CTX (eight times the MIC) or 6 g/ml of MIN (two times the MIC). But the combination of CTX at 3 g/ml (four times the MIC) and MIN at 2 g/ml (2/3 times the MIC) can inhibit A136 strain at least 48 h. A139, CTX resistant strain also had a similar inhibitory effect with the combination of CTX at 32g/ml and MIN at 4 g/ml (MIC). These results demonstrate that the combination of cefotaxime and minocycline can synergistically against A. hydrophila in vitro. In addition, we also identified an O:11 serogroup and a hybridization group (HG) among Aeromonas clinical isolates. In serogroup O:11 of Aeromonas, the ratio of blood and stool specimens was similar. Therefore, these results no longer support the relationship between serogroup O:11 and invasiveness of Aeromonas infection as was reported previously. The HGs of 75 Aeromonas strains were identified by ribotyping method and the results showed that the distribution of A. hydrophila and A. sobria, but not A. caviae were similar to that of previous report.
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