Identification and functional characterization of a novel binding site on TNF-αpromoter

Proc. Natl. Acad. Sci. USA , April 1, 2003, Vol. 100 p.4096-4101

Speaker: 陳天文

Commentator: 楊倍昌 老師

本篇論文的主要內容是在敘述: 作者如何在Tumor necrosis factor-alpha(TNF-α)的promoter區域找到一個新發現的transcriptional factor binding site以及確認出是那一種DNA binding protein，主要的大綱可分為介紹、mapping a novel transcriptional site、identify a DNA binding protein、clarify hLITAF and TNF-α promoter、結論、討論這幾個方面。

在介紹方面，就過去研究中發現TNF-α，在免疫反應中扮演著重要的角色。TNF-α主要是由單核球以及巨噬細胞所分泌，它是一個多功能的細胞素，尤其在發炎反應中扮演著關鍵性功能；TNF-α能幫助哺乳動物宿主對於傷口上入侵的微生物、寄生蟲以及體內新生成的腫瘤有免疫上的調節，它可以增加附近周邊血管上的細胞黏著分子，以及促進細胞素IL-8和IL-6的分泌，另外它也會促進細胞分泌針對巨噬細胞的趨性素，可吸引巨噬細胞來到受感染的區域，產生較強的免疫反應反清除感染源；從過去的研究中發現TNF-α的接受器主要有二種；R1及R2，它們的分子量分別是60KDa及80KDa，而R1主要是和細胞淍已相關，另一個R2則是和免疫細胞的發育生成比較相關。在前發炎細胞素中主要有TNFα、IL-1和IL-6這幾類，而TNF-α主要能刺激Dendritic cells移動到淋巴結並成熟，以促進後續的adaptive immune response；而TNF-α主要的生物功能是會產生發炎反應，發炎反應依發生的區域來分類可分為：局部和系統性二類。在局部發炎中，受感染的部位可吸引許多免疫細胞到這邊來清除入侵的微生物，能有效的保護我們不受病源的感染；但如果發炎反應太過激烈則會產生系統性發炎，這種反應對於宿主是非常不利的，因為這種反應會使身體產生過熱、發紅、全身血管通透性增大及敗血症，嚴重著導致死亡，而TNF-α在其中就很重要，因為它會散佈到血液中引發系統性發炎反應，所以調節TNF-α就顯得格外重要。

在調控某一protein的表現，最直接的方式就是從基因層面下手，而基因上調節就是看promoter上面一些transcriptional factor site，會影響到gene的transcription，從以前研究發現TNF-α promoter上有三個NFκB binding site因此可以知道NFκB對於TNF-α是很重要的，從老鼠NFκB突變實驗中發現，可有效降低TNF-α的量，但從細胞上來看，則結果有差異，因此作者認為一定有其它因素影響。

在作者1995年分析TNF-α promoter實驗中，他們發現在使用LPS的剌激之下TNF-α promoter-564到-498之間會影響到他們所接上report gene的activity，因此他們便針對這一段sequence做分析；作者在1999年的PNAS中文章提到他們是如何用分子生物學技術將和DNA所接上的protein分離出來，將所分離出來的protein定性及找出protein所在chromosome的位置，而在2003此篇論文中他們則利用了EMSA及DNase Ⅰ footprinting的技術精確的找出DNA sequence和protein之間peptides的interaction。

首先，作者利用先前找到的TNF-α transcription factor，他們命名為human LPS-induced TNF-α factor (hLITAF)的cDNA construct到表現GST的vector上，製造出GST-hLITAF的fusion protein，再利用能抓下GST的beads把fusion protein純化出來，來得到們想要的hLITAF的protein；將TNF-α promoter上找到和hLITAF的區域找到，含有64-bp的oligomers DNA，將hLITAF和oligomers DNA放在一起後，再利用DNaseⅠ這種酵素去做digestion，因為DNaseⅠ只會將DNA做適量的切割，而受到protein保護的DNA則不被影響，因此在電泳膠片上留下像足跡的空白，可以精確看出DNA上的那一段是和protein作連接，這種技術就稱為DNaseⅠ footprinting，作者找到原來是一段CTCCC的序列和protein作連接。接下來，利用一系列的hLITAF的construct來和oligomers DNA來跑EMSA；EMSA的原理是：將已知序列的oligomers DNA和proteins放在一起，再跑電泳，如果二者有連接上，則分子量會有明顯增加(形成complexs)，則在電泳膠片上看到有shift情況出現。因此，作者利用EMSA和一連串的hLITAF construct找到了hLITAF那一段peptides和TNF-α promoter DNA進行連接；經由以上的實驗後，作者以人工合成的peptides去和TNF-α promoter上來剌激實驗，看是否可利用人為方式影響TNF-α的調控；結果如作者所預期一樣。

因此在整篇論文中，作者真正的在TNF-α promoter上找到一個全新的transcription factor binding site，並且也找到了它的transcription factor命名為hLITAF，作者希望能在更加了解TNF-α上的基因調控後，未來說不定能對不同的疾病所影響的TNF-α產量，設計不同的藥物來加以治療。

DNaseⅠfootprinting

EMSA

實驗結果：

利用DNaseⅠ footprinting找出DNA上和transcription facto binding位置

EMSA結果：

利用EMSA找到hLITAF中peptides和DNA binding的位置

實驗結果：

利用hLITAF來剌激不同construct TNF-α promoter的表現

利用人工合成peptides來剌激THP-1 cell，以ELISA看TNF-α量表現