Bacterial pathogens modulate an apoptosis differentiation program in human neutrophils

Scott D. Kobayashi, Kevin R. Braughton, Adeline R. Whitney, Jovanka M. Voyich, Tom G. Schwan, James M. Musser,and Frank R. DeLeo

2003. PNAS. 100: 10948-10953.

Speaker: 姚蕙雯                          

Commentator: 何漣漪 老師

Time: 2003/12/03 pm 2:00-3:00

當發生細菌感染時，體內的免疫系統會引發acute inflammatory response來幫助自身抵抗這些外來的入侵者。首先，大量的phagocytic cells，像是macrophages、polymorphonuclear leukocytes (PMNs)等，會因為cytokines和chemokines等的作用而被recruit到發生感染的地方。一旦它們到達infection site之後，這些phagocytic cells就會利用phagocytosis來吞噬造成感染的病原菌或是其產物，同時這些細胞也會釋放出多種cytokines來協助更進一步的清除作用。雖然免疫系統引發acute inflammatory response的本意在於除去對於自身有害的外來有機物，但是過度的acute inflammation作用也會傷害到其他正常的組織。由此點來看，acute inflammation就像是雙面刃一樣，太過或是不及都會對體有不良的影響。因此，適當的調控acute inflammation response是維持本體健康的關鍵點之一。由於PMNs是acute inflammatory response中數目最多的phagocytic cells也參與反應的大部分過程，所以可以藉由控制PMNs的life span來達到適時終止反應的目的。在數篇先前的研究指出，某些造成疾病的細菌可以藉由調控PBMCs或是macrophages的gene expression來改變這些細胞的life span，進而造成宿主的免疫反應無法正常運作。利用這種方法，這些病原菌可以躲過免疫系統的攻擊，同時可以在體內造成更嚴重的疾病產生。由於PMNs在infection所引起的acute inflammatory response中扮演了重要的角色，因此，本篇的作者想知道在發生細菌感染之後，neutrophils是否也有類似的現象產生，而造成這些現象的分子機制又是什麼？因此作者設計了一系列的實驗來廣泛的探討發生在neutrophils細胞內的改變。

首先，作者測試了PMNs對五種不同bacterial pathogens (B. hermsii  、S. aureus 、Str. pyogenes、L. monocytogenes、B. cepacia)的phagocytic ability、ROS production和bactericidal activity。在這部分的實驗中，除了Str. Pyogenes之外，neutrophils都能夠有效的清除其他四種細菌。而neutrophils在面對Str. pyogenes時的清除能力是最低的。在確認neutrophils面對不同細菌的都可以作用之後，作者將這些neutrophils在不同的時間點分離出，並萃取出neutrophils的total RNA，以RT-PCR做出cDNA，之後以這些cDNA作為模板製造cRNA，同時以biotin標定在cRNA上，最後將這些產物與先前設計好的gene chips做hybridization來大量screen在neutrohpils吞入病原菌之後，細胞內的基因在表現情形上的不同。作者發現，neutrophils的global gene expression pattern會隨著與病原菌作用時間的增加而有明顯的變化。其中，與neutrophils 的proinflammatory capacity相關的基因會被down-regulation，使得neutrophils因為缺乏receptors的關係而無法對外來刺激產生反應；而與控制cell death 有關的基因的表現會傾向促進細胞的死亡。另外，作者分析了在吞入不同病原菌後，neutrophils在基因表現上的差異。當neutrophils與Str. pyogenes作用之後，細胞內的gene expression pattern發生改變的速度以及表現差異度比與其他四種病原菌作用的結果還要快速及明顯。特別是在與控制細胞存活的signaling pathway，如JAK-STAT pathway會有明顯的抑制情形出現。就microarray的結果來看，neutrophils以phagocytosis將病原菌吞入之後，細胞內的gene expression會發生大規模的改變，特別是與細胞存活以及immune function相關的基因，而其中又以與Str. pyogenes作用之後產生的改變更為強烈而迅速。作者為了確認microarray的結果，又利用了real-time PCR對選出的特定基因做測試。他們比較兩者所得的結果後確認了microarray的準確性。除此gene expression level的實驗之外，作者還以flow cytometry來分析neutrophils表面的蛋白質表現情形是否也反應了發生在transcriptional level的改變。由結果來看，neutrophils表面的蛋白質表現的確因為transcription level的改變而出現差異，但是這些差異是發生在與病原菌作用之後的晚期時間內。至於發生在作用後早期的改變可能是其他原因所引起的。最後作者又利用了TUNEL assay以及light microscope來證明gene expression pattern的改變會影響細胞的behaviors。在這部分的實驗中，neutrophils在與病原菌作用之後會有apoptosis的現象產生，特別的是，當neutrophils與Str. pyogenes作用之後會有明顯的apoptosis以及necrosis發生。

根據本篇的實驗結果，作者提出以下的結論：neutrophils在以phagocytosis將病原菌吞入後，neutrophils本身的gene expression pattern會有differentiate modulation的情形出現，特別是那些參與控制apoptosis以及immune function相關的基因。Neutrophils會因此而傾向apoptosis同時伴隨著proinflammatory capacity的降低。而在五種病原菌中，Str. pyogenes所造成的modulation與其他四種細菌相比之下會有明顯的不同，這可能是Str. pyogenes增加本身的survival所採取的一種特殊策略。另外，作者認為如果可以針對病原菌造成的gene expression pattern改變作深入的研究，也許可以對日後治療這些感染時提供合適的對策。

References：

1.      Boldrick, J. C., et al. 2002. Stereotyped and specific gene expression programs in human innate immune response to bacterial. PNAS. 99: 972-977.

2.      Nau, G. J., et al. Human macrophage activation programs induced by bacterial pathogens. PNAS. 99: 1503-1508.