前言：

Helicobacter pylori屬於多鞭毛螺旋型革蘭氏陰性菌，世界上超過50%人口曾被感染。Helicobacter pylori主要感染人類胃上皮細胞，因而容易造成胃潰瘍、胃癌…等疾病，目前已知Helicobacter pylori的毒力因子有urease, phospholipase, vacuolating  cytotoxinA (VacA)以及cytotoxin-associated gene A(CagA)。CagA的大小約為128~146kDa，其基因主要是座落在Helicobacter pylori的pathogenicity island，除了CagA外，位於此island上的基因還包括了type IV secretion system。而之前的文獻也證實Helicobacter pylori會藉由type IV secretion system將CagA送入宿主細胞內，然而CagA在宿主細胞內的功能仍不明。因此在本篇研究中，作者想探討當Helicobacter pylori感染人類胃上皮細胞時，CagA所扮演的角色為何。

    由於表皮細胞皆具有極性（方向性）及tight junction，因此為了模擬CagA在人類胃上皮細胞內的情形，作者在此次實驗中選用了一株具有極性的細胞株Madin -Darby canine kidney (MDCK) cells，希望能藉由觀察CagA與MDCK cell的交互作用，來了解CagA在人類胃上皮細胞的作用。

 

結果

（一）篩選能在MDCK cell生長的Helicobacter pylori

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

     

經由連續培養四個月之後，作者挑選G27-MA作為此次實驗用菌種。

 

 

8 h

4 h

（二）觀察Helicobacter pylori感染MDCK cell的現象

 

 

			Green: ZO-1 Blue: E-cadherin Red: H. pylori

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Helicobacter pylori主要聚集在cell-cell junction的位置，且改變了scaffolding protein ZO-1的位置。

 

（三）CagA vs adherence

 

MDCK cells

 

 

 

	Green: ZO-1 Red: H. pylori

 

 

 

 

 

1.     CagA mutant無法聚集在MDCK cell-cell junction的位置

 

 

 

			AGS cells

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.     CagA mutant無法聚集在AGS cell-cell junction的位置；然而complement CagA strain聚集位置靠近AGS cell-cell junction處。

 

由於之前有文獻指出，當CagA進入宿主細胞後，會活化SHP-2 signaling pathway進而影響細胞的外觀，因此接下來的實驗，作者想了解CagA與ZO-1之間的作用是否需要SHP-2 signaling pathway被活化。

 

			將EPIYA motif更改為EPISA
			AGS cells, 5h

 

 

 

 

 

                                    以EPISA mutant感染AGS cells仍然可

見到CagA與ZO-1有colocalization. 因此CagA與ZO-1之間的作用不需要SHP-2 signaling pathway的活化。

 

(四) CagA是否影響表皮細胞的barrier function

    

在這部分，作者分別以Ruthenium red staining及Biotinylated albumin來測試表皮細胞的barrier是否被破壞。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

以wild-type感染MDCK cells可觀察到 Ruthenium red滲透至basal-lateral space，然而CagA mutant則無。

 

 

			於24小時，只有在DVacADCagA才無法觀察到，顯示VacA及CagA皆會影響表皮細胞的barrier.             A

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

因此經由上述結果得知CagA會破壞MDCK cells的tight junction.

最後，作者想了解是否由於CagA的作用而導致MDCK cells的morphology產生改變。

 

 

		Nonadherent H. pylori		DCagA
								MDCK cells, 7d
									Green: ZO-1 Yellow: actin
							經由結果得知，長時間以wild type 感染MDCK cell確實會造成MDCK cells的morphology產生改變，然而此現象在CagA mutant則無。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

			經由結果顯示，CagA與MDCK cells scaffolding protein ZO-1, JAM位於同一fraction,  然而在CagA mutant則無。下圖顯示H. pylori 與ZO-1, JAM的相對位置。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

			Green: ZO-1 Blue: H. pylori Red: JAM

 

 

 

 

 

 

 

 

結論：

Helicobacter pylori感染人類胃上皮細胞時，會藉由type IV secretion system將CagA送入上皮細胞，一旦CagA進入上皮細胞後，便會影響上皮細胞的scaffolding protein的分布，進而破壞上皮細胞的外觀。