Seminar 中   文   報   告

微免所 碩士班 二年級   許  聿  翹

講評老師： 賴 明 德  老師

Loss of the cylindromatosis tumour suppressor inhibits apoptosis by activating NF-kB

Brummelkamp, et al. Nature 424:797

1.       Introduction：

Ø          Familial Cylindromatosis 是一種遺傳性疾病，通常患者會在汗腺或毛囊長出良性的腫瘤，這種疾病目前無藥可醫，且被發現是和位在chromosome 16的CYLD gene出現突變有關。

Ø          CYLD是一種De-ubiquitinating enzyme，目的是移除protein上被標示的ubiquitin。

2.       Strategy：

在本篇paper之中，作者利用一種High-throughput screening的方式，將50種人類的de-ubiquitinating enzymes (DUBs)依據其序列各設計4個RNAi knockdown vector。 接著進行NF-k B luciferase reporter Assay，找出只有一組的RNAi vectors會增強在TNF-a-activation誘導下的NF-kB表現。這一組DUB即為Cylindromatosis tumour suppressor gene (CYLD)。

接著作者進行實驗來確認是否CYLD參與在NF-kB signalling pathway及其扮演的角色。

3.  Preliminary data：

CYLD 在先前的yeast two hybrid assay中被證實會和NEMO(NF-kB Essential Modulator，又名Ikkg)binding。

A. The effect of CYLD on IKK activity：

Ø          作者利用IP的方式證實CYLD會和NEMO結合，影響IKK complex的activity。

Ø          進一步，作者以In vitro kinase assay證明CYLD並不影響IKKb activity；但是CYLD knockdown會降低IkBa levels(an endogenous substrate of IKKb kinase)。

Ø          作者以CYLD knockdown及在active site Cys具有point mutant的CYLD做實驗，證明CYLD是透過其de-ubiquitinating enzyme activity of對NF-kB產生影響。

B.   CYLD’s substrates：

Ø          TNF receptor-associated factors (TRAFs)是Adaptor proteins that couple the TNF receptor family to signaling pathways。其中TRAF2,TRAF5 and TRAF6已被證實可以調控NF-kB和JNK的活化。

Ø          TRAF2可以藉由其Lys 48或Lys 63的位置與ubiquitin chains連結。而of TRAF2被報導是利用其Lys 63位置與ubiquitin連結導致non-destructive lysine-63 poly-ubiquitination來引導NF-k B-inducing activity。

Ø          Conclusion: The effect of CYLD on NF-kB activation is mediated by CYLD-dependent de-ubiquitination of TRAF2。

C.        Apoptosis Assay：

Ø          作者經由TNF-a及cycloheximide誘發的apoptosis assay來證實失去CYLD 可以導致anti-apoptotic情形，而且是源自於NF-kB的activation。

Ø          利用pretreat Aspirin或prostaglanding A1(PGA1)的方式，發現Aspirin 可以abolished CYLD^KD對保護細胞免於apoptosis的功能。

4.  Possible application：

Velcade是一種 proteasome inhibitor，可以blocks NF-kB activity，已經被美國食品暨藥物管理局(US Food and Drug Administration)核准可以當做一種治療multiple myeloma的藥物。

目前Familial Cylindromatosis還是一種無藥物治療的遺傳性疾病，也許藉由Aspirin的給予，可以抑制NF-kB過度活化造成的腫瘤。目前這項實驗已進入clinical trial，也許再過不久，這項困擾許多家庭許久的疾病，就不再是那麼令人痛苦了。

5.       References：

1.      Bignell, G. R. et al. (2000) Identification of the familial cylindromatosis tumour-suppressor gene. Nature Genet. 25,160–165.

2.      Brummelkamp, T. R., Nijman, S. M., Dirac, A. M., Bernards, R. (2003) Loss of the cylindromatosis tumor suppressor inhibits apoptosis by activating NF-kB. Nature 424, 797-801.

3.      Yin, M. J., Yamamoto, Y., Gaynor, R. B. (1998) The anti-inflammatory agents aspirin and salicylate inhibit the activity of IkB kinase-b. Nature396, 77–80.