TIMP-2 Mediated Inhibition of Angiogenesis: An MMP-Independent Mechanism

Cell 114, 171–180, 2003.

Speaker:陳宇楓

      這篇文章主要分為兩個部份, 作者由先前研究發現Tissue inhibitors of metalloproteinase-2 (TIMP-2)除了抑制matrix metalloproteinase (MMP)活性之外, 仍具有其他功能, 所以第一部份在找尋TIMP-2在血管內皮細胞上的Receptor, 確定細胞上的Receptor後, 作者又進一步探索TIMP-2是透過什麼樣的機制來完成這樣的功能。

      在一般正常成人體內除了傷口癒合以及女性生理週期之外, Angiogenesis是不被大量表現的。Angiogenesis不同於胚胎早期發育時的Vasculogenesis, Vasculogenesis 是由血管前驅細胞在Growth factor 誘導下從沒有血管到形成血管組織, 而Angiogenesis則是由已存在的血管經由血管內皮細胞的Growth factor 刺激下, 血管內皮細胞Migration以及Smooth muscle cell到這兒聚集而形成血管組織。而科學家又發現癌症形成後的轉移現象和Angiogenesis是密不可分的, 抑制Angiogenesis似乎對於遏止癌症轉移是有效的。 先前研究指出TIMP Family可以藉由 NH₂-terminal cysteine domain來執行protease inhibition功能(也就是抑制MMP活性), 藉由 COOH-terminal hemopexin-like domain 來調解cell surface activation。而作者就從之前自己實驗室研究發現在basic fibroblast growth factor (bFGF)誘導下, TIMP-2 有抑制Human microvascular endothelial(HME) cell proliferation 的現象延續本篇的實驗。

       作者先證實TIMP-2 有抑制HME cell proliferation 作用而且是和抑制MMP活性完全不相關, 也就是此作用不需要有抑制MMP活性而且具有Concentration dependent現象; 因為先前報導TIMP-3可以經由和VEGF receptor-2結合而達到Anti-angiogenesis作用, 所以作者也懷疑TIMP-2是否經由競爭VEGF receptor 而達到Anti-angiogenesis效果, 但實驗證明TIMP-2不與VEGF receptor結合; 又因為之前研究發現Platelet factor-4 可以在有Heparin 存在下抑制FGF-2 dimerization而達到Anti-angiogenesis作用, 所以作者也在有Heparin 存在下證明TIMP-2並不抑制FGF-2 dimerization; 以及先前研究指出一些Anti-angiogenic factor, 如Endostatin, Thrombospondin和Tumstatin可以經由直接或間接和 Endothelial cell 上的Integrin 作用而達到Anti-angiogenesis效果, 還有作者未發表的資料中顯示TIMP-2和A549細胞的b1 integrin有Colocalization現象, 所以分別從以下三個實驗證實Endothelial cell 上的 a3b1是TIMP-2的Receptor:

(1) Integrin-blocking antibody competition binding assay-

(2) Integrin binding assay-             (3) Immunoprecipitation-

        確定endothelial cell 上的integrin a3b1為TIMP-2的receptor後, 作者又以b1 null fibroblast來確認其proliferation並不受TIMP-2影響(抑制)。

作者很好奇這樣的作用是透過何種機制來達成抑制Human microvascular endothelial cell (hMVEC) proliferation 的現象。所以他們試圖將Protein tyrosine phosphatase (PTP) 和TIMP-2 扯上關係, 在 FGF receptor和 VEGF receptor 的Intracellular domain是為 Receptor tyrosine kinase (RTK), 當RTK Autophosphorylation 時, Signal 便由細胞外向內傳, 可以促使細胞不斷地 Proliferation, 而PTP是可以將這種 Autophosphorylation 的情況做一個阻斷的動作, 所以作者選用一個PTP inhibitor, Orthovanadate 來進行以下的實驗, 他們先確定 Human microvascular endothelial cell (hMVEC) proliferation是和 PTP activity 相關, 在有Orthovanadate處理之下同時給予TIMP-2, 可以將單獨給予TIMP-2處理的抑制現象反轉回來, 也就是說TIMP-2和 Integrin結合後, 有Orthovanadate將PTP阻斷, RTK就可不受限制將 cell proliferation signal 往細胞內傳。

以上的結果由Nature 425, 139-141, 2003用以下的圖可以清楚的說明:

當沒有TIMP-2存在下, PTP是和Integrin intracellular domain結合在一起的, 此時FGF-2和VEGF可以分別和Receptor結合促使Angiogenesis; 但是當有TIMP-2存在下, TIMP-2 與Integrin結合, PTP便由Integrin intracellular domain解離下來而和FGF-2或VEGF的Receptor上RTK有阻斷作用, 使RTK不能Autophosphorylation

, 即使FGF-2和VEGF可以分別和Receptor結合, 也不能達到Angiogenesis。

        總結本篇研究證實TIMP-2和TIMP-3除了有抑制MMP活性之外, TIMP-2可以經由和 Integrin a3b1結合, 而TIMP-3則是和 VEGF receptor-2結合來達到Anti-angiogenesis效果。而且也可以部份說明臨床上 synthetic MMP inhibitor在對於癌症轉移治療上的失敗, TIMP-2在Animal model研究上, 已確實有Anti-angiogenesis以及抑制腫瘤生長的效果。