Tumor Necrosis Factor Alpha Induction of NF-kB Requires the Novel Coactivator SIMPL

Molecular and Cellular Biology, Nov. 2004, p. 9317-9326

學生:莊旭翔  學號:S46931017

TNF-a (腫瘤壞死因子) 是pro-inflammatory cytokines的其中一員,其主要的功能在於當innate immunity的activator.當我們用TNF-a處理細胞時,可以活化NF-kB-dependent signal pathway.而活化的NF-kB可以進入細胞核中活化一些發炎相關的基因.

作者在這裡發現,在TNF-a活化NF-kB的訊息傳遞路徑中,需要一個未知的蛋白質,這裡簡稱為SIMPL.

在先前的研究中,作者利用yeast-two hybrid assay篩選出來SIMPL這個蛋白質可以和IRAK-1互相作用;而在這篇論文中,作者將SIMPL的功能及它在訊息傳遞路徑的角色做了一些研究.

在table1中,作者將SIMPL做了序列上的分析,發現在其amino acid序列的C端發現了一個lysine-rich domain,而在經過一些氨基酸序列的比對發現是nuclear licalizational signal (NLS),證實SIMPL有進入細胞核所需的序列.

Fig1A可以看見當我們送入可以表現SIMPL的載體時,可以看見SIMPL能在細胞核及細胞質都有表現;當我們將SIMPL的NLS deletion可以看見,這樣的突變蛋白質不能進入細胞核中;這樣的結果證實了這一段NLS確實可以幫助SIMPL這一個蛋白質進入細胞核中.

在Fig1B,當我們送入帶有IL-8 promoter的luciferase vector及帶有SIMPL sequence vector進入細胞後,我們可以看見,SIMPL可以使luciferase的表現量增加;而SIMPLDNLS並不能促進luciferase的表現量增加;結果證實了SIMPL入核的能力,在活化NF-kB-dependent IL-8 promoter contruct 的表現是被需要的.

在Fig2,作者也證實了,在細胞被TNF-a處理之後,所經由TNF RI而活化NF-kB的訊息傳遞路徑時,SIMPL是一個組成因子,而且可以調控NF-kB的活性.

在證實了上述的事情之後,作者做了一個假設:是否SIMPL調控NF-kB的活性是否是藉由如同c-Jun、C/EBPb可以和NF-kB結合而使的NF-kB活化基因的表現量增加所致.作者在Fig3A、B、C、D證實了,SIMPL有像c-Jun、C/EBPb的活性進而促進p65-dependent gene transcription.

作者在ectopic的condition下看見了,SIMPL具有促進p65-dependent gene transcription的功能存在後,作者想知道:是否在endogenous的condition下,SIMPL也具有一樣的功能,而Fig3E、F證實了SIMPL可以促進endogenous p65-dependent gene expression.

因此,作者想知道是否SIMPL可以和NF-kB的p65 interaction而促進NF-kB的活性增加,作者用了免疫沉澱法 (immunoprecipitation)來證實此假設;FigA、C證實了在TNF-a的處理下,可以促進SIMPL和p65結合.

在知道SIMPL和p65可以結合、SIMPL具有入核的能力兩件事之後,作者假設SIMPL可以調節p65進入核的能力,而使的NF-kB入核的能力增加,而導致受到NF-kB活化的genes表現量增加.作者在Fig5A中利用indirect immunofluorescence assay證實:SIMPL不能促進NF-kB入核的能力增加.

因此,作者假設SIMPL可以使的核內的p65活性增加可能是藉由:1.使NF-kB結合上DNA的能力增加; 2.活化NF-kB的transactivational domain.兩種方式.

在data not present中,作者證實了SIMPL不能使的p65結合上DNA的能力增加.

作者外送了一個帶有GL4 DNA binding domain和p65 transactivation domain sequence的construct,當我們外送construct表現SIMPL時,SIMPL如果和 p65 transactivation domain interaction可以促使此fusional protein活化reporter gene.

  由Fig6可證實,SIMPL可以促使p65 transactivation 的活性增加.

  而作者也更進一步的利用NF-kB-dependent endogenous IkB gene expression 證實上述的結果是存在的; Fig6C表示:當利用TNF-a處理細胞後,活化IKK complex 導致IkB被磷酸化而被降解,使的NF-kB可以入核進行IkB gene的transcription,因此,IkB隨時間的增加而漸漸回復;然而,當我們送入SIMPL antisense construct去抑制細胞內endogenous SIMPL時,我們可以看到,因為SIMPL的量降低而導致NF-kB transcription activity降低,其IkB的回復量下降.證明了在真實細胞的環境下,SIMPL確實可以促進p65 transactivation activity而當NF-kB的coactivator.

  作者在Fig6D中提出了一個模式,當用TNF-a處理細胞時,會使的NF-kB被釋放出來,進入細胞核中,而這時,SIMPL可以進入細胞核中和NF-kB結合後,促進NF-kB transcription的能力增加.

  這一篇論文的重要性在於:一般哺乳動物的基因上的promter有許多不同的transcriptional factor binding sites,而許多外來因素活化許多的transcriptional factors的共伴效應可以使的其transcript出來的基因表現量不同;在這裡,作者提供了另一個解釋,就是雖然同樣受到TNF-a的刺激而活化IKK complex,但是,在不同的組織因為SIMPL的表現量有差異,而使的受到活化的基因表現量有所差異.

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          Data 所呈述的事實很漂亮,可以很有力的證實其假設.