當pathogen入侵人體，與Toll-like receptor結合，促始一連串的signal transduction產生，而turn on一些pro-inflammation cytokine 的gene expression，這當中包含了TNF-a及IL-8。而TNF-a不但可以促使IkB被degradation，而活化NF-kB入核，也能up-regulate TLR2的表現，使得TLR2表現量上升。如此反覆循環便造成TNF-a不斷表現，而可以放大inflammation及immune response。不過，我們的身體總不能一直持續在進行inflammation，所以TNF-a及IL-8會刺激HPA axis使得glucocorticoid（GC）被release。Glucocorticoid經血液循環回到inflammation site，進入細胞與glucocorticoid receptor（GR）結合，抑制pro-inflammatory cytokine表現。最後便使得immune response及inflammation可以降下來。

雖然在臨床上GC都是用做immunosuppressive的藥物，但是卻有文獻指出在in vitro的狀況下，GC可以促使某些TLR的gene expression。除此之外，更有人證明了被G（+）bacteria感染的肺表皮細胞，給予GC後反而使得TLR2的gene expression上升。於是本篇作者想要更進一步地探討GC促使TLR2的gene expression相關的分子機制。

作者在這篇文章所用的是A549的cell line，所有的實驗皆是in vitro。

由Fig.1可以知道，TNF-a可以induce IL-8的mRNA表現（inflammation），而GC（Dex）則是抑制IL-8的mRNA（anti-inflammation）。但有趣的是，TNF-a及Dex都可以促使TLR2的mRNA表現量上升。所以我們便可知道，在A549 cell line的系統下，Dex雖然具有anti-inflammation的功能，但同樣地，Dex也能induce inflammation。

因為TNF-a及Dex都可以使TLR2的mRNA上升，於是作者將二者同時treat A549 cell，發現不管是mRNA level或是protein level，TNF-a及Dex具有cooperative effect的作用，可以使TLR2的表現遠比單獨treat TNF-a或Dex來得高很多（Fig.2A & 2C）。不過，對於IL-8來說，Dex會抑制TNF-a的作用。另外作者也加入RU486（GC antagonist），證明了這樣的cooperative是需要GR參與其中的（Fig.2B）。

既然已經知道TNF-a + Dex對於TLR2具有cooperative effect，作者便更往前探討，是不是promoter activity在影響這樣的機制。利用deletion的方式，將TLR2的promoter自5’端往3’端做mutantion，其後再接上一段luciferase作為reporter gene。由Fig.3可知，pGL3-297的5’端可能是調控cooperative effect的關鍵因素，並且pGL3-297與pGL3-1486的promoter activity對於TNF-a及（或）Dex的作用都相差不多，在作者的觀點，甚至是一模一樣。（Fig.3A）另外，利用RU486也證明了GR參與了對於pGL3-297 promoter activity的cooperative effect（Fig.3B）。

接著，我們要來檢視一下，到底是pGL3-297的哪一部分是關鍵因素，為什麼pGL3-201的cooperative effect會消失。首先作者發現不管是3’端的NF-kB binding site或是NF-kB是否能進入細胞核，對於cooperative effect都很重要（Fig.4）。

另外，STAT binding site以及STAT能否形成Dimer也很重要（Fig.5A & 5B）。

既然pGL3-297 的NF-kB binding site及STAT binding site對於cooperative effect都是不可或缺的，並且pGL3-201也擁有NF-kB binding site，那麼到底是什麼原因使得pGL3-201的cooperative effect消失？於是，作者將這兩個transcription factor binding sites之間插入了300bp或600bp，或是將一些片段deletion，想要從中了解這2個binding site的關係。從Fig.5C我們可以知道，當NF-kB及STAT binding site距離太遙遠時，cooperative的機制就減弱了。這似乎是告訴我們一個訊息，NF-kB及STAT的binding site都影響著promoter activity的cooperative effect，但是當這2個binding sites距離太遙遠時，這樣的機制會減弱，若是無窮盡地遙遠（相當於其中一個binding site被deletion），則cooperative effect就消失了。

先前的文獻指出，GR可以與STAT有協同作用，可以共同turn on某些gene expression，並且使得表現量大增，不過這樣的協同作用是需要GR的AF-1 domain存在。因為GR及STAT都參與了TLR2的cooperative effect，於是作者聯想到GR的AF-1 domain，不知AF-1在這機制中扮演什麼樣的腳色。由Fig.6，我們知道GR的AF-1 domain以及3’端的GRE對於此cooperative effect是必須的。

現在，已經知道NF-kB binding site、STAT binding site、GRE以及NF-kB、STAT、GRE對於cooperative effect都是不可或缺的，那麼我們接著要了解，treat TNF-a及（或）Dex時，這3個transcription factor對於TLR2 promoter binding的情形如何。利用ChIP（Chromosomal immunoprecipitation）的方式，發現只有同時treat TNF-a及Dex才會使得GR或NF-kB或STAT都可以binding到TLR2的promoter。（Fig.8）

利用transfection發現，在同時treat的情況下，endogenous GR也會binding到外送的PGL3-297。（Fig.9A）

另外，若是pGL3-297的STAT binding site或NF-kB binding site或GRE被mutation，則GR便無法與pGL3-297結合。（Fig.9B & 9C）

到目前為止，作者已經證實了TNF-a及Dex對於TLR2具有cooperative regulation，並且也了解其中的分子機制。在A549 cell line的系統下，同時給予細胞TNF-a及Dex的刺激，會使得TLR2的mRNA、protein、promoter activity都有大量上升的情形，這當中的反應包含了NF-kB、STAT以及GR都會與promoter結合，並且缺一不可。

因為一些科學家發現當細胞被pathogen感染，且給予Dex時，可以觀察到TLR2及MPK-1的表現大量上升，於是本篇作者又做了Fig.7的實驗，證實了在A549 cell line的系統下，給予Dex也能使得MKP-1的mRNA及protein表現量上升。

最後，將作者的discussion及我的看法總結一下。在文中作者有提到，TNF-a以及Dex的cooperative effect是cell type specific，這情形在肺表皮細胞及macrophage都有發生，但是肝細胞卻沒有此一機制。也許就是因為肺表皮細胞本身的TLR2很少，所以若是GC被induce出來就要抑制免疫反應，則很可能會造成pathogen還沒清除乾淨，inflammation已經降下來了。不過，也有人會反問”如此不是會造成身體一直持續發炎嗎？”這問題我也想過，有些reference提到pathogen會induce GR的產生，所以我絕得當pathogen被清乾淨了就不會有GR，而即使有GC，沒有receptor與之binding一樣不會有功能。另外，免疫反應到後來，IL-10的產生也是可以將免疫反應抑制下來的。但是，最關鍵的還是在於GC出現的時間點。對於pro-inflammation cytokine如何刺激下視丘、腦下垂體及腎上腺，使之產生GC，，這機制目前仍不清楚，需要多大的刺激或是多久的刺激才會產生GC，目前也不知道。如果我們清楚了解GC的一切，加上動物實驗，也許就能解答每個人的疑惑。

其實我本來有畫了一個說明整個生理意義的圖，但是畫到一半我就畫不下去了，原因是太多矛盾，我連自己都無法說服，要如何present給大家聽？找了很多的reference都找不到相關的，最後，我只能說，這是in vitro的實驗，必須要再繼續做動物實驗，我們才有可能更透徹地明瞭這樣的cooperative機制。如果只是片面從這篇paper要我說明整個生理意義，或是回答”以後是不是不能用GC來治療病人，否則會發炎更嚴重”，我想我無法回答。這篇paper給的訊息實在太少，但也不是沒有貢獻，至少我們知道在in vitro的情況下，原本應該是anti-inflammation的GC竟然也會有inflammation的情形，並且會與TNF-a有cooperative effect。由於在in vitro已經知道有這樣的現象，也明瞭了相關分子機制，所以更能推動我們做in vivo的實驗，並且在將來的醫學應用上，GC的應用也許可以更多元化，而不單單只是拿來做免疫抑制而已。