Autoimmunity is trigged by cPR-3 (105-201), a peptide complementary to human autoantigen proteinase- 3.

Nat. Med 10 : 72 - 79, 2004.

Speaker : 藍保欣                       Time : 2004/12/1 13:10~ 13:50

Commentator : 黎煥耀 老師              Place : Room 601

    自體免疫 ( autoimmunity )到現在對於其如何以及為何發生都尚未有一個非常清楚的了解，雖然目前已知有一些可能的機制。如: sequestered antigen的出現，molecular mimicry，某些MHC class II complex的不正常表現，Polyclonal B-cell 的活化。而作者之前研究antineutrophil cytoplasmic autoantibodies ( ANCA )的時候，意外發現在病人的血清中，原本用來當作控制組的，有proteinase-3 (以下簡稱PR-3)的互補蛋白質的抗體出現，所以才引起作者進行這部份研究的動機。而作者在閱讀過前人的相關研究之後，綜合了前人所提出的idiotypic network之觀念以及蛋白質和互補蛋白質之間的作用之後，提出了autoantigen complementarity這個理論，詳見下圖 :

    這個理論是在敘述當平時很少表現的PR-3互補蛋白質出現時，會引起對抗其的抗體出現，而這個互補蛋白質的抗體會去活化PR-3的抗體，之後這些被活化的抗體會去辨識PR-3，進而去攻擊PR-3，因此產生了自體免疫的現象。

而作者的實驗設計大致是先利用ELISA，IgG staining，westsern boltting來檢測患有PR-3疾病的病人之血清中是否真的含有PR-3的互補蛋白質的抗體存在。如果有出現抗體，再來利用ELISA，affinity column，westsern boltting測試這些抗體是否是distinct或是polyclonal的抗體，排除了polyclonal抗體的可能性之後，再來利用ELISA，affinity column觀察PR-3的蛋白質與其互補蛋白質的抗體間是否會互相結合而存在著idiotypic pair的關係。接著利用老鼠為animal model進行in vivo的實驗來重複in vitro的實驗，期望得到相同的結果而證實其假設。最後，作者利用RT-PCR在RNA level上，來看病人血清中除了有抗體存在之外，是否有transcript也存在其中，並且利用了一些軟體的預測，來探討在環境中是否有與PR-3互補蛋白質的結構相似的pathogen存在。

     關於實驗結果方面，作者首先做了一個construct，是可以表現具有his tag的PR-3的互補蛋白質(以下簡稱cPR-3)。接著利用ELISA來測試ANCA病人體內是否存在cPR-3的抗體以及其專一性高低，結果發現有7/34的病人有此抗體，而且專一性高。雖然數目看起來有點少，不過作者提出了兩個解釋，首先是此重組的cPR-3因為缺少N terminal所以結構上的改變使得抗體對其辨識度下降，或是因為個體之間的抗體所辨識的epitope不同，所以會造成差異。在western blotting的結果中也顯示，在ANCA病人血清中存在的cPR-3的抗體可以與重組的cPR-3結合且產生co-immunaprecipitation。在利用病人的cPR-3的IgG來做免疫染色也可以發現其會與重組的cPR-3結合。以上的結果可以顯示，病人體內確實有cPR-3的抗體存在，並且這些抗體可以專一性的去辨識重組的cPR-3。

     接著作者將病人的血清通過表面附著有PR-3的affinity column，發現只有PR-3的抗體可以與PR-3結合而不會濾出，而cPR-3的抗體會隨血清濾出，代表了cPR-3的抗體不是因為PR-3引起polyclonal activation所產生的抗體，而是可以專一地去辨識cPR-3的專一性抗體。接著作者將affinity column表面的附著物改成PR-3的抗體，將病人的血清再通過此column一次，發現到cPR-3的抗體可以與PR-3的抗體互相結合而不被濾出。所以證明了這兩個抗體間存在著idiotypic pair的關係。接這作者拿老鼠來當作animal model，將cPR-3打入老鼠體內，觀察其免疫反應的過程，將血清取出，做ELISA test。之後發現，確實PR-3和cPR-3的抗體隨著時間的增加，都有越來越高的表現量，如下圖。之後在免疫螢光染色的實驗中也發現，不管是老鼠或視病人的PR-3的抗體都可以專一性的辨識病人的PR-3。接著作者將老鼠的血清和病人的血清分別通過表面各自附著有病人的PR-3之IgG和老鼠的PR-3之IgG，發現老鼠血清中的cPR-3的抗體可以與病人的PR-3之IgG結合，而且病人血清中的cPR-3的抗體也可以與老鼠的PR-3之IgG結合，而代表了這些老鼠以及病人的抗體間存在interchangeable的關係。

    接著作者利用生物資訊軟體的預測發現，PR-3與cPR-3之間可能有可以互相結合的domain，之後作者將純化過後的PR-3倒入表面附著有His tagged cPR-3的nickel charged plate中，經過wash之後，發現PR-3確實可以與cPR-3結合而不被洗去。而之前的軟體預測中也發現，PR-3上會與cPR-3結合的domain上存在其酵素活性的active site，所以推測結合之後PR-3的活性消失，之後在PR-3的活性測試中發現其活性確實有因為與cPR-3結合而產生下降的現象。

     之後作者利用RT-PCR發現，病人體內確實存在著cPR-3的transcript，所以在RNA level上也發現與前面實驗相同的結果，再次驗證了前面的實驗結果之正確性。最後作者利用SwissPort的軟體預測出一些帶有與cPR-3相似蛋白質序量的pathogens，提出這些pathogens的感染可能也是引起cPR-3抗體出現而導致產生自體免疫現象的假說。而這些pathogens其中有一些已經被證實可能會引起ANCA疾病。

    最後在討論中，作者提出這個autoantigen complementarity可能會是一些自體免疫疾病產生的原因之一，而在一些前人對於自體免疫疾病的研究中也發現有相似的結果，如 : SLE，Sjogren syndrome和myasthenia gravis。最後作者提出，在未來的研究中可以將這些互補蛋白質的抗體當作研究如何治療自體免疫疾病的一個目標，來研發新的治療方式，期待外來在自體免疫疾病的治療上能有重大的進展。

References :

1. Heal JR, et al. Specific interactions between sense and complementary peptides: the basis for the proteomic code. Chembiochem. 3:136-51, 2002.

2. Routsias J.G., et al. Idiotype-anti-idiotype circuit in non-autoimmune mice after immunization with the epitope and complementary epitope 289-308aa of La/SSB: implications for the maintenance and perpetuation of the anti-La/SSB response. J Autoimmun. 21:17–26, 2003.

3. Pendergraft WF 3rd, et al. Autoimmunity is trigged by cPR-3 (105-201), a peptide complementary to human autoantigen proteinase-3. Nat. Med 10:72-79, 2004.