Seminar中文報告 微免所碩一 學號：S46931033 鄭智仁

摘要：

在這篇paper指出Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC)會deliver它們的translocated intimin receptor (Tir)，嵌入host細胞膜上，然後利用自己的表面蛋白-intimin，與Tir相互反應，當Tir與intimin做結合，造成Tir上的Tyrosine 474的位置被磷酸化，使adaptor protein—Nck聚集過來，然後使signal往下傳，造成actin的聚合反應。此外，作者發現Tir的磷酸化和Nck-dependent的產生柱狀結構，皆需要Src-family kinase中c-Fyn的反應。在之前的研究發現Tir的磷酸化，主要發生在Tyr 474的位置，因此作者比較Tyr 474附近的amino acid sequence發現這段motif與c-Src tyrosine kinase的target motif相似，所以作者猜測造成Tyr 474的磷酸化，和Src-family kinase有很大的關連性。作者利用一連串的Tyrosine kinase的inhibitor來做實驗，觀察Tyr 474磷酸化和細胞形成柱狀結構的情況，再利用endogenous的RNA interference發現當knock down c-fyn則看到Tyrosine的磷酸化和柱狀結構的情形，明顯被抑制下來。根據這些實驗結果，作者發現在Tyr 474磷酸化和Nck-WASP-Arp2/3 cascade中扮演kinase的角色，就是屬於Src-family kinase中的c-fyn。

首先，作者利用分析Tir上Tyr發生磷酸化位置的sequence，和Tir上其他Tyrosine的位置，如Table.1

從sequence analysis，，可以發現Tir上Tyrosine磷酸化的位置，是與Src family kinase的target motif非常相似，所以作者做以下的實驗。

利用priming和challenge的實驗，將這一連串的反應，切開來看，先看當用Tir去priming細胞，再用intimin去challenge細胞，用免疫沉澱法把Tir抓下來，做western blot，以anti-pTyr的抗體，看是否有磷酸化的現象，再用免疫螢光染色來看intimin和Tyrosine磷酸化有沒有關係，這些實驗，作者要先看他們實驗室所建立的這個system是可以work的，如下圖：

     HA-Tir-primed          HA-Tir-primed         HA−Tir^Y474F-primed

                             +E. coli pInt           + E. coli pInt

之後，作者利用不同作用的Tyrosine kinases inhibitor來處理細胞，可以看到處理專一性抑制Src-family kinase的inhibitor，則Tyr的磷酸化被抑制下來了，而且E. coli附著在細胞的數目和宿主細胞產生柱狀結構的比率下降了，如下圖：

作者再以不同Src-family kinase knockout的細胞，來做priming和challenge的實驗，並觀察其對嵌入細胞膜的Tir上的磷酸化發生哪些現象，如下圖：

最後，利用siRNA的實驗，來看當knockdown不同的Src-family kinase對細胞產生哪些影響，結果如下圖：

所以作者根據pharmacological inhibitor、konckout和siRNA knockdown的實驗，去看western blot和免疫螢光染色法，觀察是哪一種Src-family kinase造成Tir上Tyrosine磷酸化的情形。

這篇作者發現了細胞Nck–WASP–Arp2/3 cascade和細菌的Tir之間的一個重要角色—c-Fyn，這邊也啟發我們對於分析tyrosine kinase的signalling，可以有比較容易處理的實驗系統。