Ectodomain shedding of the glycoprotein GP of Ebola virus

微免所碩二 姚蕙雯 S46921038

Ebola virus (EBOV)伊波拉病毒，是一種屬於絲狀病毒科(filoviridae)的負單股RNA病毒，可分為四種亞型，分別為薩伊(Zaire)、蘇丹(Sudan)、象牙海岸(Ivory coast)及雷斯頓(Reston)，前三種對人類都有很高的感染率及致死率，而第四種只會對猴子有致病力。EBOV的感染主要是藉由被病毒污染的血液和體液來傳播到新的宿主身上。直到目前為止，對於EBOV造成感染的致病機轉並不十分清楚，只知道免疫系統的無法對於EBOV的感染產生適當的反應進而清除病毒是造成高致死率的可能原因。

EBOV的genome是由七個基因所組成，其中的GP 基因可以藉由alternative splicing來產生兩種不同的蛋白質，分別為nonstructural glycoprotein sGP和surface GP

，這兩種蛋白質在結構以及功能上都有很大的差異；以後者來說，surface GP是由兩個次單位(subunit)，GP₁和GP₂所組成，主要負責構成病毒結構上的spike的部分，可以幫助病毒辨認並進入宿主細胞。而在之前的研究中指出，surface GP對vascular cells具有cytotoxicity並會造成cellular detachment。另外，也有研究發現，EBOV在感染細胞後會釋放出大量的virosome-like particles (VLPs)，這些VLPs主要是由病毒外套膜(envelope)上的surface GP所組成，因此surface被認為是一個EBOV感染的致病因子。在本篇研究中，作者想進一步探討，在感染細胞之後，EBOV是如何釋放出這些由surface GP所構成的VLPs的詳細分子機制。意外的是，除了由GP_1,2所組成的VLPs之外，還有另一種帶有truncated GP_2D的soluble GP也會被釋放到細胞外。藉由分析這兩種GP₂上被醣化(glycosylation)的情形，可以知道的是，truncated form與VLPs之間的差異並不是來自於醣化的程度不同，而是有其他的原因造成這樣的現象。為了更進一步了解GP_1,2D的來源以及如何被釋放到細胞外，作者利用pulse-chase labeling以及surface biotinylation證明了GP_1,2D是在細胞膜上產生後再被釋放到細胞外，而釋放GP_1,2D的過程可能是經由細胞酵素的參與，這與VLPs的製造與釋放的過程有非常大的不同。

一般來說，正常的細胞會利用一些酵素，像是matrix metalloproteases或是ADAMs來將嵌在細胞膜表面的醣蛋白分子釋放到外界環境，這樣的過程稱作ectodomain shedding。目前已知有許多醣蛋白分子都需要經過這個機制來執行功能，如cytokines、cytokines的受體、生長激素(growth factor)或是細胞黏附因子(cell adhesion molecules)等。以tumor necrosis factora (TNF-a)為例，當TNF-a由細胞中製造出來時是以transmembrane protein的形式被嵌在細胞膜上，一旦身體需要TNF-a執行功能時，原本嵌在細胞膜上的TNF-a就會被那些metalloprotease將突出於細胞膜表面的部分切下，然後釋放到外界環境中，進而達到systemic availability。然而，除了細胞本身所產生的這些醣蛋白分子會透過ectodomain shedding的機制而被釋放到環境中之外，在本篇研究中的truncated surface GP_1,2D也會透過相同的機制而被釋出。當細胞被EBOV感染之後，嵌在細胞膜上的surface GP會被細胞的zinc-dependent metalloproteinases所辨認，特別是TNF-a converting enzyme (TACE或ADAM 17)，然後由GP₂ subunit上的第637個氨基酸(D₆₃₇)的位置切開，使得surface GP以GP_1,2D的形式由細胞膜表面被放到細胞外。根據immunoprecipitation的結果發現，這些被釋放到細胞外的可以被virus-neutralizing antibody所辨認並結合，而在被EBOV感染動物的血液內也可以發現大量GP_1,2D的存在，同時，隨著GP_1,2D的量增高，被感染動物的疾病嚴重程度和死亡率也會隨之上升。總結本篇研究，作者發現當EBOV感染細胞之後，病毒表面的surface GP可以透過ectodomain shedding的機制以GP_1,2D的形式被釋放到外界環境中，這是首次發現病毒的surface glycoprotein可以作為細胞酵素ADAM的受質，同時，這些被大量進入血液中的GP_1,2D可以阻斷virus-neutralizing antibodies的作用，這可能與EBOV感染時的致病機制有極大的關聯性。

 The ectodomain shedding of (1) TNF-a；(2) EBOV surface GP.