Protein Kinase G from Pathogenic Mycobacteria Promotes Survival within Macrophages

張力云

Introduction

        Mycobacteria 屬於不會形成孢子之好氧菌,其又被稱為acid-fast bacilli是因其細胞具有很厚的一層脂質層,使得mycobacteria無法在酸性溶劑中進行褪色而得以觀察其存在;也因為其脂質層的存在處使其可以抵抗一些抗生素及消毒劑等等◦由於mycobacteria的細胞壁非常的複雜,因此造成其生長速度非常緩慢且為此菌的重要毒力因子之一,然而此菌的所引發的疾病多是由於寄主本身的免疫系統所造成而不是因為毒力因子所造成◦

        我們都知道當致病菌進入到人體內後,我們的免疫系統就會執行其功能以控制疾病的產生,而其中一個方式便是利用吞噬細胞將這些進入體內的病菌藉由endocytosis包裹在phagosome中,進而與lysosome進行fusion,而將病菌給清除,但是mycobacteria卻可以阻止phagosome與lysosome的fusion而可以在寄主中繁殖生長,但是是透過怎樣的一個機制目前不是非常的清楚,因此本篇作者就想要進一步了解Mycobacteria是透過什麼樣的物質或是方式而使其可以抑制phagosome與lysosome的fusion◦

      由於Mycobacteria tuberculosis的基因體解出後加上從過的研究顯示一些細菌會encode protein kinase 而去調控寄主細胞的生理反應,因此作者推測是否在Mycobacteria存在著protein kinase進而影響phagosome與lysosome的fusion,透過序列比對發現其中一個protein kinase G (PknG) 與人類的protein kinase Ca類似,而其在功能會去調控phagosome與lysosome的fusion,因此,作者就想進一步去推測是否protein kinase G在阻止phagosome與lysosome的fusion上是否扮演重要的角色◦

Result

        首先作者利用deletion的方式將M. bovis BCG中的PknG去除,觀察此deletion是否會影響其生長或是外觀,結果顯示PknG並不會影響到細菌本身的外型及生長,因此作者進一步將菌感染macrophage後,利用瑩光顯微鏡觀察PknG是否會影響phagosome與lysosome的fusion,從實驗結果可發現若是將PknG deletion則大部分的Mycobacteria會存在LAMP-positive的phagosome中(圖一),而在cell fraction的實驗當中也看到相似的結果(圖二),即在lysosome的fraction中可偵測到大量的Mycobacteria在其中,除此之外,偵測wild-type與mutant strain在macrophage的存活情形發現mutant strain無法在macrophage中生存◦接著作者將PknG送到不會表現PknG的M. smegmatis 看是否能夠促使這菌株得以在macrophage中生存,不論是螢光顯微鏡下所觀察到的或是透過cell fraction的結果皆可發現只要有PknG存在的情形下,mycobacteria可以存活在macrophage中而不會在lysosome中發現他們的存在,以上顯示著PknG能夠抑制phagosome與lysosome fusion而影響mycobacteia在macorphage的生存◦

               圖一                               圖二

由於PknG類似protein kinase,因此作者想要了解kinase activity對於mycobacteria在抑制phagosome與lysosome fusion上是否扮演重要的角色,作者建構一株 kinase-dead mutant of PknG ( PknGK181M)的菌株去感染macrophage,從螢光顯微鏡下以及cell fraction的結果顯示若是PknG不具有kinase的活性就無法阻止phagosome與lysosome fusion而使得大量的mycobacteria死亡◦因為mycobacteria可能透過磷酸化寄主細胞的蛋白質而改變寄主細胞的生理功能,因此進一步作者想要了解PknG釋放出來後會在macrophage的何處,從SDS-page及immunocytochemistry的結果看出只有當細菌是存活且具有kinase活性的情形下,PknG會釋放到macrophage的細胞質當中,進而去影響細胞蛋白的磷酸化◦

        既然知道PknG可以透過kinase的活性而改變細胞trafficking,作者認為可能可以透過抑制kinase的活性而改變mycobacteria在細胞中的行為,因此作者從50000種藥物當中篩選是否有藥物能夠專一性的抑制PknG的活性而不會影響protein kinase Ca的活性,很幸運的作者發現到一種藥物tetrhydrobenothiophene(圖三)能夠有效的抑制PknG的作用,且此藥物很明顯的可以抑制mycobacteria的生長而不會影響到macrophage的生存,而在mycobacteria在感染macrophage的培養液中加入此藥物可從螢光顯微鏡下觀察到大量的細菌會存在lysosome中而大量的死亡,顯示此藥物可以抑制PknG的作用而使得phagosome與lysosome fusion◦

        近年來由於抗生素的濫用造成許多抗藥菌珠的產生,透過本篇實驗的結果,可以了解到mycobacteria是透過PknG的作用而得以在細胞中生存而不會被人類的macrophage給清除掉,除此之外,作者也發現到tetrhydrobenothiophene可以有效的將存活在macrophage的細菌給殺死,這似乎對於越來越嚴重的抗藥性菌珠的問題,提供了另一個藥物選擇的方向◦

  圖三   tetrhydrobenothiophene