TGF-b directly targets cytotoxic T cell functions during tumor evasion of immune surveillance

Cancer cell 8: 369 - 380, 2005

Speaker : 藍保欣                        Time : 2006/03/15 13:10~ 13:50

Commentator : 王崇任 醫師               Place : Room 601

    Transforming growth factor-beta (TGF-b)在20年前左右就已經被發現，其對於cell growth, cell survival, migration and immunosuppression 的調控扮演著非重要的角色。此外TGF-b本身也是一個重要的tumor suppressor，近年研究發現，在人類許多癌症當中都有發現到癌細胞本身會產生基因上的突變，導致TGF-b signaling pathway無法順利傳導，所以無法抑制癌細胞的生長，例如 : TGF-b receptor, 或是TGF-b signaling pathway下游重要的訊息傳遞分子Smads，都有被報導出來在某些癌症當中有突變的情形。所以針對TGF-b對於癌細胞的影響，前人已經完成非常多的研究，但是TGF-b就像是把雙面刃，雖然可以當作tumor suppressor，其本身也會抑制免疫反應的發生，例如:會抑制T cell activation, IL-2 production, APC的antigen-presentation，所以有些癌細胞本身會分泌TGF-b或是會引起宿主本身的細胞產生TGF-b，而這些TGF-b會抑制免疫反應，藉此逃避免疫細胞的攻擊。但是對於TGF-b抑制T cell功能的詳細機制，目前尚未有非常詳細的了解，所以本篇作者就是在討論TGF-b是如何去影響到cytotoxic T cell (CTL)的功能，而導致癌細胞無法順利被清除。作者首先利用EL-4 thymoma cells當作model，EL4 cells的特色是其本身會分泌TGF-b，而且也會引起宿主細胞產生TGF-b，所以會引起systemic TGF-b production。而早期研究有指出，如果中和systemic TGF-b便可以讓CTL有效的清除cancer cell，所以作者首先將EL-4 cell打入老鼠體內，接著利用了兩種方式來中和TGF-b，第一種是利用retrovirus讓EL4 cell表現TGF-bsiRNA來抑制EL4 cells所分泌的TGF-b，另一種方法是讓EL4 cells表現soluble TGF-b receptor II來中和systemic TGF-b。結果發現只有後者能讓CTL有效的清除cancer cells，有效提高老鼠的生存率，由此結果可知，宿主本身產生的TGF-b是systemic TGF-b的主要來源，而利用soluble receptor中和的方式也是可行的。接著作者將mouse primary T cells以TGF-b處理，之後利用Affymetrix mouse genome microarrays來做transcriptomic profiling分析細胞的gene expression pattern，接著再利用northern blotting, ELISA, intracellular staining, 和 flow cytometry來觀察基因的mRNA以及protein expression。發現TGF-b會抑制CTL的perforin, granzyme A, granzyme B, fas ligand 和 interferon g 的表現，而這些cytotoxic genes對於CTL cytotoxicity非常重要。另一方面T cell activation在實驗中並沒有發現有被TGF-b所抑制的現象。作者接著分析這些cytotoxic genes是否受到TGF-b induced Smad signaling pathway直接調控，作者分別clone不同長度的granzyme B的promoter sequence，再利用reporter assay來分析，發現如果缺失了promoter上一個ATF1/CREB bind site，抑制的效果就消失了，而利用CHIP assay，也證明了Smad, ATF1, CREB確實會與granzyme B的promoter sequence結合。接著作者利用RNAi來knockout ATF1, CREB, Smad2/3，結果也發現TGF-b對於cytotoxic gene expression的抑制效果也消失或是減少了，此實驗結果告訴我們ATF1和CREB可能參與在TGF-b 透過 Smad signaling pathway去直接抑制granzyme B基因表現的機制當中，並且扮演Smad的corepressor。接著作者分析經過TGF-b處理過的antigen-specific T cells其 cytotoxicity的強弱，發現經過處理後T cells其cytotoxicity會降低，無法有效清除tumor cells，而且前面所提到的cytotoxic genes的表現也有下降的情況，因此才會造成T cell的cytotoxicity過低而無法殺死癌細胞。接著作者想探討的問題是，以前的研究就已經知道TGF-b會抑制IL-2 production，進而影響到activated T cell proliferation，作者在懷疑這種anti-mitogenic effect是否與anti-cytotoxic effect有相關，所以作者利用在有持續處理TGF-b的情況下，外加 IL-2來觀察T cell的proliferation和cytotoxic genes expression，結果發現雖然在處理24小時左右，IL-2可以回復部分的 T cell proliferation，但是卻無法回復在0~4小時就被TGF-b所抑制的cytotoxic gene expression，也告訴我們TGF-b抑制cytotoxic genes expresion的現象與抑制活化的T cell proliferation的現象，兩者之間沒有直接的關聯。作者另外也發現，經過TGF-b處理36小時的T cell，如果在移去TGF-b的培養環境中外加IL-2培養36小時，其T cell proliferation和cytotoxic genes expression可以回復，而外加IL-15則只能部份回復T cell proliferation。最後作者將OVA當作specific antigen表現在EL4 cell或是表現soluble TGF-b receptor II的EL4 cell上，再分別打入不同老鼠體內，接著觀察老鼠體內OVA-specific T cells的activation, proliferation和cytotoxic gene expression。發現打入EL4-OVA cells的老鼠體內，與打入EL4老鼠比較起來，其T cell activation不受TGF-b影響，而T cell proliferation以及cytotoxic gene expression 都有被抑制的情況。而打入可以表現TGF-b receptor II來中和systemic TGF-b的EL4的老鼠，其體內T cell activation, proliferation和cytotoxic gene expression都可以回復到正常的活化及表現程度。所以整體實驗結果很清楚告訴我們，TGF-b可以藉由抑制CTL的cytotoxic genes的表現來降低CTL cytotoxicity，而使得CTL無法有效清除癌細胞，因此癌細胞可以逃過免疫機制的攻擊。

References :

1. Derynck R., et al. TGF-beta signaling in tumor suppression and cancer progression. Nat. Genet. 29:117-129, 2001.

2. Gorelik L. and Flavell R.A. Transforming growth factor beta in T cell biology. Nat. Rev. Immunol.. 2:46-53, 2002.

3. Thomas D.A. and Massagué J. TGF-b directly targets cytotoxic T cell functions during tumor evasion of immune surveillance. Cancer cell 8:369-380, 2005.