Clostridium difficile toxin CDT hijacks microtubule organization and reroutes vesicle traffic to increase pathogen adherence

Schwan C, Kruppke AS, Nölke T, Schumacher L, Koch-Nolte F, Kudryashev M, Stahlberg H, Aktories K.

Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Feb 11;111(6):2313-8

Speaker: Bo-Yang Tsai (蔡博仰)                                   Time: 13:10~14:00, Oct.8, 2014

Commentator: Dr. I-Hsiu Huang (黃一修老師)           Place: Room 601

Abstract:

                 近年來，國際上出現所謂的高毒力困難梭狀桿菌菌株，這類菌株能夠產生更多的毒素A與毒素B造成臨床病人更嚴重的症狀。此外，高毒力菌株可以產生特殊的二元毒素（CDT）去抑制宿主的Actin聚合。然而，作者過去的研究發現CDT會抑制宿主F-actin的聚合並產生由microtubule組成的突觸，進而增加細菌的附著能力。[1]因此，在本篇作者他們想探討CDT究竟是透過什麼機制去影響細菌的附著能力。首先，作者使用低溫電子顯微鏡觀察CDT所產生的突觸，發現突觸中存在microtubules, membrane tubules以及vesicles，進一步在螢光顯微鏡下觀察帶有GFP的ER標定蛋白後，發現在CDT treatment下ER會位移到突觸的裡面。過去有研究指出ER可藉由Stim1與microtubule作用，而Stim1是一個鈣離子感受器分佈在ER膜上，可以活化細胞膜上的Oria1產生鈣離子訊號（store-operated calcium entry, SOCE）。[2]然而，其他的研究也曾提到短時間內增加細胞內的鈣離子濃度將會引起胞吐作用。[3]因此，作者想知道Stim1是否參與在CDT所引起的ER位移以及對於鈣離子的訊號有無影響。所以作者使用sh-RNA去knockdown Stim1，結果發現knockdown Stim1將大大的減少ER位移到突觸的現象並阻斷原本受CDT所提升的鈣離子訊號。連結以上發現的結果可以知道Stim1涉及在CDT所以引起的ER位移以及鈣離子訊號增加。進一步，作者想知道CDT是否影響vesicles運輸與分泌，進而增加細菌的附著能力。作者使用了vesicles運輸與分泌的抑制藥物BFA，結果發現BFA能顯著降低CDT所誘發的附著能力，以上結果可以推測vesicles的運輸與分泌可能參與在細菌附著能力的上升。所以作者接著利用帶有螢光的Rab11 constructs去transfect細胞並利用帶有綠色螢光的Fibronectin作為培養細胞的基底質，其結果顯示在CDT treatment下Rab11將引導帶有Fibronectin的vesicles從細胞底部運送到上半部並累積在突觸的底層，最終增加細菌的附著能力。最後，作者想測試鈣離子訊號增加是否會影響到CDT誘發的Fibronectin運輸以及分泌，作者使用鈣離子訊號阻斷劑2-APB，結果發現2-APB會顯著減少CDT誘發的Fibronectin分泌與重新分佈。同樣的結果在作者knockdown Stim1後也看到，顯著的降低細菌附著能力。總結以上所有發現，可以知道C. difficile的附著能力是受到CDT誘發的Fibronectin重新分佈所調控，另外這個調控路徑需要Stim1-dependent的鈣離子訊號。

參考文獻

1.    Aktories, K., et al., Actin as target for modification by bacterial protein toxins. FEBS J, 2011. 278(23): p. 4526-43.

2.    Grigoriev, I., et al., STIM1 is a MT-plus-end-tracking protein involved in remodeling of the ER. Curr Biol, 2008. 18(3): p. 177-82.

3.    Barclay, J.W., A. Morgan, and R.D. Burgoyne, Calcium-dependent regulation of exocytosis. Cell Calcium, 2005. 38(3-4): p. 343-53.