Chondroitin sulfate proteoglycan 4 functions as the cellular receptor for Clostridium difficile toxin B

Yuan P, Zhang H, Cai C, Zhu S, Zhou Y, Yang X, He R, Li C, Guo S, Li S,

Huang T, Perez-Cordon G, Feng H, Wei W.

Cell Res. 2015 Feb;25(2):157-68

Speaker: Bo-Yang Tsai (蔡博仰)                                 Time: 14:10~15:00, Mar. 18, 2015

Commentator: Dr. I-Hsiu Huang (黃一修老師)           Place: Room 601

Abstract:

    困難梭狀桿菌是目前造成全球抗生素相關腹瀉的主要致病菌， 其感染症狀的產生是因為細菌產生的毒素A與毒素B，這兩個毒素組成結構相似，都是轉醣基酶可以抑制宿主Rho家族的GTPase像是Rac1和Cdc42等蛋白，導致宿主細胞骨架被破壞甚至是死亡。過去對於兩毒素的重要性一直存在爭議性，直到2009年的研究證明了毒素B對於困難梭狀桿菌的毒力是必要的。[1] 目前普遍認為毒素所造成的細胞毒性是藉由受器所主導的胞吞反應，但過去對於毒素受器的研究並不多，只有毒素A的受器曾被報導過，而對於毒素B的受器更是一無所知，只知道毒素B的受器與毒素Ａ的受器並不相同。[2] 所以本篇作者建立一個功能性篩選系統去尋找毒素B的受器。使用帶有shRNA library的慢病毒去感染Hela細胞並加入毒素B與這些細胞共同培養。之後將存活下來抗毒素B的細胞做克隆分離並增值培養後，分離這些細胞的genomic DNA並利用PCR去放大轉錄出shRNA的區段做定序，再透過比對分析找出可能的候選基因。作者找到兩個不同的shRNA可以標定相同的基因，這個基因是一個表面蛋白的基因CSPG4。接著作者就利用TALEN技術來踢除Hela細胞的CSPG4，證明CSPG4確實涉及毒素B所引起的反應。然而binding assay的實驗也發現細胞表面附著毒素B的量與CSPG4的表現量呈現正相關，這代表著CSPG4對於毒素B的附著與內化都是重要的。 進一步作者clone出不同長度的CSPG4與毒素B，並藉由Co-IP與pull-down assay的方式去研究兩個蛋白間彼此的交互作用。結果顯示CSPG4可以利用N端直接與毒素B的C端非CROPs區域作用。另外，作者發現使用這樣純化的CSPG4毒素結合區胜肽鏈可以保護細胞免於毒素B所造成的毒殺影響。最後動物實驗的數據也顯示小鼠少了CSPG4/NG2基因確實可抑制毒素B所造成的發炎因子IL-8的上升，但對於小鼠的存活率卻沒有顯著性的影響。總結，再者篇文章中作者首次證實毒素B受器的存在並發現不同以往CSPG4所扮演的功能與角色。

References:

1. Lyras, D., et al., Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature, 2009. 458(7242): p. 1176-9.

2. Na, X., et al., gp96 is a human colonocyte plasma membrane binding protein for Clostridium difficile toxin A. Infect Immun, 2008. 76(7): p. 2862-71.