CRISPR-Cas9和R-loop所形成的複合物透過結構改變而使CRISPR-Cas9將目標DNA進行切除

論文：Jiang, F., Taylor, D. W., Chen, J. S., Kornfeld, J. E., Zhou, K., Thompson, A. J., Nogales, E., and Doudna, J. A., et al. Structures of a CRISPR-Cas9 R-loop complex primed for DNA cleavage. Science 351, 867-871 (2016).

報告者：吳彩瑜                   時間：14:00-15:00, Apr. 27, 2016

講評老師：莊偉哲老師       地點：Room 601

摘要

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein (Cas)系統為許多細菌以及古細菌中的的免疫系統，利用此CRISPR-Cas系統可以將外來的基因片段清除¹，除此之外，此系統會將外來基因片段納入CRISPR中作為spacer，若再次遇到相同外來物攻擊可以馬上做出回應以消除外來片段，因為此過程類似於人體中具有記憶性的後天免疫系統，因此又被稱為細菌中的後天免疫系統，而根據不同種類的cas基因可將CRISPR系統分為三大類，而其中第二類的CRISPR系統中只需要Cas9蛋白對外來物進行消除，因此被研究的比較透徹²。在第二類的CRISPR系統中，CRISPR RNA(crRNA)會協同trans-activating crRNA (tracrRNA)將外來的雙股DNA打開，並且取代非目標DNA(non-target DNA)和此片段形成helix，crRNA會誘導Cas9對此外來的目標DNA進行切除³。然而，在目前已知的結構研究中，Cas9中的兩個催化區HNH以及RuvC domain並沒有和目標DNA位於有效的作用位置，且在R-loop和Cas9蛋白之間的交互作用尚不清楚，因此，為了要更進一步的了解Cas9蛋白和R-loop之間的關係，本篇作者利用蛋白質結晶學方式取得Streptococcus pyogenes Cas9-sgRNA-dsDNA complex結構，進一步利用這個完整的結構解釋Cas9和R-loop之間的交互作用。從這個結構中可以看到RuvC domain的位置接近於non-target DNA，而且在打開雙股DNA片段的過程中，會促使Cas9蛋白的結構產生改變，進而使HNH以及RuvC domain更靠近其作用的DNA位置，除此之外，作者也利用cryo-electron microscopy (cryo-EM)的方式發現Cas9蛋白會抓住雙股DNA打開的兩端，使得DNA產生彎曲，而這樣的R-loop結構可以穩定Cas9蛋白，促使CRISPR-Cas系統更精確地將外來基因物質消除。

參考資料

1.         van der Oost, J., et al. Unravelling the structural and mechanistic basis of CRISPR-Cas systems. Nature reviews. Microbiology 12, 479-492 (2014).

2.         Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602-607 (2011).

3.         Szczelkun, M.D., et al. Direct observation of R-loop formation by single RNA-guided Cas9 and Cascade effector complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111, 9798-9803 (2014).