CHD8 suppresses p53-mediated apoptosis through histone H1 recruitment during early embryogenesis

(於老鼠胚胎發育過程中，CHD8可透過histone H1以抑制p53-mediated apoptosis)

Nishiyama, M et al. 2009. Nature Cell Biology 11: 172 – 182

Speaker:陳奐勻                                           Time: 15:10~16:00, Apr. 22, 2009

Commentator: 劉校生老師                       Place: Room 601

細胞凋亡(apoptosis)，又稱為細胞計劃性死亡(programmed cell death)，為細胞受外界環境刺激後，在基因調控之下所產生的自然死亡現象，在細胞發育過程中扮演重要角色。然而在胚胎發育過程中細胞凋亡如何被調控目前仍不甚清楚。Chromodomain helicase DNA-binding (CHD) family最早於老鼠個體中發現，可調控老鼠的immunoglobulin promoters；其中CHD8(duplin)參與β-catenin and Wnt signaling pathway並與調控子(CTCF, CCCTC- binding factor)作用以調節胚胎發育時基因的表現。之前的研究顯示：CHD8於老鼠胚胎發育早期表現，若將胚體中的chd8基因knockdown，則老鼠胚胎發育會受到抑制甚至導致胚胎死亡。因此作者首先以retrovirus system使CHD8於入NIH 3T3細胞大量表現並以會誘導細胞凋亡的藥劑處理，確認CHD8會抑制細胞凋亡；接著再分別以會誘導p53 dependent apoptosis及p53 independent apoptosis的藥劑處理大量表現CHD8的NIH 3T3細胞，發現CHD8主要抑制p53 dependent apoptosis；此外利用CHD8 shRNA抑制U2OS cells (p53^+/+ ) CHD8表現，則細胞死亡率提高，因此作者初步證明CHD8會抑制p53 dependent apoptosis(圖一)。接著作者以免疫染色分析(Immunostain analysis)、GST pull-down及免疫共沈澱分析(co-immunoprecipitation, co-IP)等方式進一步證實CHD8與p53兩者間有直接的交互作用(圖二)。此外，並以retrovirus system使CHD8於細胞中大量表現後以免疫轉漬分析法(immunoblot analysis)及定量RT-PCR分別偵測p53下游target gene表現情形；此外，作者再以染色質免疫沉澱分析(CHIP assay)得知CHD8可與p53下游target gene promoter結合進而抑制p53下游target gene表現。綜合上述實驗結果發現：CHD8透過與p53下游target gene promoter結合以抑制p53轉錄活化作用(transcriptional activation)，進而調控p53 dependent apoptosis(圖三)。另一方面，作者以shotgun  proteomics approach找出於CHD8抑制p53 dependent apoptosis過程中，histone H1亦扮演重要角色。作者利用HH1c^–/–HH1d^–/–HH1e^–/– triple-knockout (TKO) embryonic stem (ES)證實若細胞中的histone H1 knockout則p53下游target gene表現提高。此外，CHD8與histone H1的免疫共沈澱及定量RT-PCR分析實驗結果也顯示：CHD8可透過histone H1抑制p53 dependent apoptosis。上述個體外(in vitro)的實驗結果明確顯示：CHD8可透過histone H1抑制p53 dependent apoptosis。因此作者進一步進行老鼠活體 (in vivo)試驗，將CHD8及p53 knockdown並觀察老鼠胚體發育會發現：在組織切片及體外培養老鼠胚胎均可發現老鼠胚胎發育會受到抑制。此外針對老鼠胚體進行定量RT-PCR偵測p53下游target gene表現情形，也發現CHD8會抑制p53下游target gene表現。由上述活體 (in vivo)試驗也得到相同結論：CHD8可透過histone H1抑制p53 dependent apoptosis。

(a)               (b)                        (c)

圖一、(a)以retrovirus system使CHD8於入NIH 3T3細胞大量表現並以會誘導細胞凋亡的藥劑處理，確認CHD8會抑制細胞凋亡。(b)以會誘導p53 dependent apoptosis及p53 independent apoptosis的藥劑處理大量表現CHD8的NIH 3T3細胞，發現CHD8主要抑制p53 dependent apoptosis。(c)利用CHD8 shRNA抑制U2OS cells (p53^+/+ ) CHD8表現，則細胞死亡率提高。

圖二、(a)p53與CHD8兩者共同存於細胞核中。(b)(c)免疫共沈澱分析(co-immunoprecipitation, co-IP)等方式進一步證實CHD8與p53兩者間有直接的交互作用。

圖三、由定量RT-PCR及染色質免疫沉澱分析偵測p53下游target gene表現情形，由實驗結果得知CHD8可與p53下游target gene promoter結合進而抑制p53下游target gene表現。

(a)

                                            (b)

圖四、(a)將CHD8及p53 knockdown在組織切片可發現老鼠胚胎發育會受到抑制。(b)在老鼠胚胎發育過程CHD8可透過histone H1抑制p53 dependent apoptosis。

References:

1.      Jesenberger V, Jentsch S. 2002. Deadly encounter: ubiquitin meets apoptosis. Mol Cell Biol Rev 3: 112-121.

2.      Hall JA, Georgel PT. 2007. CHD proteins: a diverse family with strong ties. Biochem Cell Biol 85: 463-476.