論文：MicroRNAs expressed by Herpes simplex virus 1 during latent infection regulate viral mRNAs

Umbach, J. L., M. F. Kramer, I. Jurak, H. W. Karnowski, D. M. Coen, and B. R. Cullen. 2008. Nature 454:780-3.

報告者：胡瑄耘              時間：15:00~16:00, Nov.12, 2008

講評老師：陳舜華 老師      地點：Room 601

摘要：單純疱疹病毒(Herpes simplex virus)屬於疱疹病毒科(Herpseviridae)的ㄧ員，其可分為兩種類型HSV-1及HSV-2，皆為神經侵襲性的病毒，並且會造成潛伏期感染。一般來說，HSV-1主要在唇、嘴、鼻、下巴、臉頰產生病灶，而HSV-2則主要造成生殖性疱疹。疱疹病毒嚴重感染的話有可能會造成腦膜炎、角膜結膜炎，甚至死亡。本篇主要探討HSV-1在潛伏期感染時會有microRNAs的表現，而去調控病毒本身基因的表現。HSV-1的基因組中包含94個ORF(open reading frame)，可以轉譯出80個病毒蛋白。主要感染於神經元細胞，並在細胞核中複製，造成細胞死亡。某些細胞可以藉由宿主的免疫系統而去抵抗病毒的感染，使得病毒進入感覺神經元中進行潛伏期感染，直到受到刺激後，才會再活化起來進行急性感染。在HSV-1處於潛伏期時，所有的病毒基因都不會表現，但唯獨latency associated transcript (LAT)這個基因例外。LAT是一段不轉譯出蛋白質的RNA，對於病毒的複製不重要。在先前的研究指出，LAT對於潛伏感染有著調控的功能，但是詳細的機制目前還不清楚 (4)。在2006年，Cui等人對於HSV-1進行microRNAs的研究，發現所找到的microRNA, miR-H1，它是由LAT star site上游的序列所encode出來的 (2)。MicroRNAs (miRNAs)是一段小、短，大約22個核苷酸，不會轉譯出蛋白質的RNA，它可以結合至特定的mRNAs上，去調控基因的表現，而影響許多機制，例如：細胞增殖、分化以及細胞凋亡。本篇文章作者的假設是想要知道LAT是否還可作為HSV-1其他miRNAs的precursor。作者利用去建立一個18~24 base pair小RNA片段的complementary DNA library，去搜尋在LAT這段序列中可能為miRNAs的序列。研究發現LAT可做出四個miRNAs，分別為miR-H2, miR-H3, miR-H4,及miR-H5，並且找到另一個來自於LAT promoter上游的第五個miRNA, miR-H6。去研究這些microRNAs的target site發現，miR-H2-3p可以結合至ICP0 mRNA，ICP0 protein是由immediate-early gene轉譯出來的，為一個轉錄因子，可以去調控病毒的複製並且協助病毒由潛伏再活化的過程。MiR-H3, miR-H4則可與ICP34.5 mRNA互補，ICP34.5 protein是一個神經毒性因子，具有anti-host defense的功能。MiR-H6則發現可以結合至ICP4 mRNA上，ICP4 protein是β, γ基因的transcriptional activator，並且會抑制其他immediate-early gene。而在針對這些miRNAs是否真的可以作用在相對的mRNAs上的研究中發現，miR-H2-3p可以結合至ICP0 mRNA上，而抑制ICP0 protein的表現，但在ICP0 mRNA level上則沒有影響。相同的情形也在miR-H6與ICP4 mRNA之間看到，miR-H6可以抑制ICP4 protein，但對於mRNA level則沒有影響。此外，作者還發現miRNAs在與mRNAs結合的那段序列必須是完全配對的，才有作用。總結以上，本篇文章作者找到了五個miRNAs，並且發現了除了LAT可作為primary miRNA precursor之外，LAT promoter上游的序列也可做出miRNA。這些miRNAs是可以結合至病毒本身的mRNAs上，而去調控一些基因的表現。因此，指出了在潛伏期時，HSV-1也許可以藉由表現miRNAs進行post-transcription的調控，去影響病毒基因表現，而達到協助建立及維持病毒潛伏期感染。

LAT在HSV基因序列中是一段獨特的基因，它似乎扮演著某種角色，但目前我們並不是非常的清楚。有些研究指出LAT與潛伏和細胞凋亡有著關係 (1)。之前就有研究指出LAT的序列是與病毒的某些基因是互補的，但他們彼此之間是否有作用，是不完全清楚的。而本篇作者進行了HSV-1 miRNAs的研究，與先前相似的研究最大不同的是，他們只針對LAT這段序列去進行miRNAs的搜尋，而不是病毒全部的基因。這也是因為LAT這段基因有些獨特的特性是與miRNAs的特性相符合，例如：LAT這段RNA並不是很穩定且不會轉譯出任何的蛋白質，利用電腦分析LAT的序列可以預測到有pri-miRNA-like hairpin的存在 (3)。此外，他們利用了cDNA library建立的方法去進行miRNAs的搜尋，並非先前人家所使用利用miRNAs特性去篩選的方式。他們方法的優點是可以比較精確的找到miRNAs，但相對的也需要花費較多的金錢在DNA序列的分析上。作者所使用的策略成功的地方是，他們將重點放在一個已經知道可能會做出miRNAs的序列，並且利用比較精確的方式去進行研究。HSV-1 miRNAs的發現可以解釋LAT與病毒基因序列互補可能發生的機制，並且也知道在潛伏期時，病毒可以透過miRNAs的表現，而去調控病毒自己本身的基因。本篇文章對於HSV-1的研究上讓我們更進一步了解病毒作用的機制，而在miRNAs上的研究方法策略上也有所改變。讀了這篇文章之後，我們還進一步想去知道HSV-1所表現出來的這些miRNAs除了去調控病毒自己本身的基因外，是否也會去影響宿主的基因表現呢？或者是宿主可以做出miRNAs去調控病毒的基因表現，這之間的關係還需要進一步的去研究了解。而在HSV-1潛伏期感染的研究中較困難的地方是，在動物實驗的模型中很難模擬出人類潛伏期感染的情形，目前較接近的動物模式是兔子，也會有類似人類HSV-1感染再活化的現象。目前對於HSV-1感染的治療多是支持性的療法，利用藥物去抑制病毒的複製，但無法完全消滅病毒。對於HSV-1我們還有許多地方是不了解，因此需要繼續去研究，希望在未來能夠找出對抗病毒的方法。

參考資料：

1.         Bloom, D. C. 2004. HSV LAT and neuronal survival. Int Rev Immunol 23:187-98.

2.         Cui, C., A. Griffiths, G. Li, L. M. Silva, M. F. Kramer, T. Gaasterland, X. J. Wang, and D. M. Coen. 2006. Prediction and identification of herpes simplex virus 1-encoded microRNAs. J Virol 80: 5499-508.

3.         Cullen, B. R. 2006. Viruses and microRNAs. Nat Genet 38 Suppl: S25-30.

4.         Thompson, R. L., and N. M. Sawtell. 1997. The herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript gene regulates the establishment of latency. J Virol 71:5432-40.